[發明專利]從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法

有效

• 申請號: 201910003963.X
• 申請日: 2019-01-03
• 公開（公告）號: CN111394250B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 鄭瑾;季遠玲;陳宏坤;王曉玲;杜顯元;陳昌照;于文赫;宋佳宇;張坤峰
• 申請（專利權）人: 中國石油天然氣集團有限公司;中國石油集團安全環保技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/00;B09C1/00
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 閆加賀;姚亮

本發明提供一種從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法，包括將無機鹽培養基與高含油土壤樣品混合培養，利用稀油/無機鹽培養基對混合培養后的培養液進行馴化培養，再利用稠油/無機鹽培養基對馴化培養后的培養液進行馴化培養，將所得培養液稀釋后涂布于原油/無機鹽固體平板培養基上并進行培養；再經純化得到形態一致的純化菌株，將純化菌株于牛肉膏蛋白胨培養基中進行培養，將所得菌液接種至原油/無機鹽液體培養基中進行原油降解實驗；測定該純化菌株原油降解率，選擇原油降解率較大的菌株。該方法可獲得能具有廣譜降解原油中各組分能力的石油烴降解菌，具有廣泛的應用性及較高的使用價值。

技術領域

本發明涉及一種從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法，屬于石油烴生物降解處理技術領域。

背景技術

作為重要能源的石油是近代工業的“血液”，但是石油在給人類帶來快捷便利的同時，也造成了越來越嚴重的環境污染。石油在開采、運輸、貯藏、加工過程中因意外事故或管理不當，都會使石油排放到土壤、地下水、海洋等，使環境遭受污染，直接危害人類生產與生活。石油污染治理主要有物理、化學和微生物等方法。物理化學法存在能耗多、成本高和二次污染嚴重等缺點，微生物法通過石油類污染物在微生物的新成代謝循環中得到轉化和去除，使被污染環境恢復其天然功能，具有費用低、環境影響小以及應用范圍廣的優點。

由于自然的選擇和淘汰作用，在長期被石油烴類污染的環境中一般存在著不同種類能夠降解石油烴的菌種，在自然環境中他們往往是水體或土壤中石油烴類污染物生物修復的主力軍。因此篩選高效石油烴降解菌是當前石油污染土壤微生物修復技術的研究熱點。

目前，在本領域常規的富集分離純化降解菌株的方法中，所用的碳源通常是一種組分的原油，較為單一。如：中國專利CN 102021132 A公開了利用逐漸增加一種組分原油含量的方法進行嗜油菌的馴化過程。但其所篩選菌株對于原油中重質組分的耐受性和適應性較差，抑制了菌種對于重質組分含量較高的稠油的降解，因此，應提高菌種對各種組分的原油污染環境的適應能力，促進其對不同組分原油的降解效率。

發明內容

為了解決上述的缺點和不足，本發明的一個目的在于提供一種從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法。本發明利用重質組分逐漸增加的原油對石油烴降解菌進行逐級富集馴化的方法從含原油土壤中分離純化獲得能夠具有廣譜降解原油中各組分能力的石油烴降解菌，最終實現對土壤中石油烴的有效去除。

本發明的另一目的在于提供所述從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法得到的高效石油烴降解菌純菌株。

本發明的又一目的還在于提供所述高效石油烴降解菌純菌株在修復原油污染土壤中的應用。

為了達到以上目的，一方面，本發明提供了一種從原油污染土壤中分離與純化高效石油烴降解菌的方法，其中，所述方法包括：

(1)將無機鹽培養基與高含油土壤樣品混合后進行培養，得到富集后的培養液；

(2)將無機鹽培養基與稀油混合，得到混合液A，再將步驟(1)所得富集后的培養液加入到所述混合液A后進行培養；

(3)將無機鹽培養基與稠油混合，得到混合液B，再將步驟(2)所得富集后的培養液加入到所述混合液B后進行培養；

(4)將步驟(3)所得培養液稀釋后涂布于原油/無機鹽固體平板培養基上并進行培養；再經純化得到形態一致的純化菌株；

(5)將步驟(4)所得純化菌株于牛肉膏蛋白胨培養基中進行培養，培養后得到菌液；隨后將所述菌液接種至原油/無機鹽液體培養基中，以進行原油降解實驗；再測定該純化菌株原油降解率，選擇原油降解率較大的菌株作為所述高效石油烴降解菌純菌株。

根據本發明具體實施方案，在所述的方法中，所述高含油土壤樣品為于4℃冰箱中保存的樣品。