[發(fā)明專利]逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910003911.2
• 申請(qǐng)日: 2019-01-03
• 公開（公告）號(hào): CN109735507A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范潔;蘇財(cái)忠;童涌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州藥明康德檢測(cè)檢驗(yàn)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權(quán)

本發(fā)明公開一種逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)方法，是采用鼠源細(xì)胞培養(yǎng)病毒，鼠源細(xì)胞的培養(yǎng)基的血清濃度在培養(yǎng)期間通過逐步遞減，用含較低濃度血清的培養(yǎng)基更換逐步更換高濃度血清的培養(yǎng)基；每天收獲病毒培養(yǎng)上清，并每天補(bǔ)充低濃度血清的培養(yǎng)基；收獲的培養(yǎng)上清經(jīng)低速離心后，直接采用高速離心獲得病毒沉淀，重懸病毒沉淀，分裝獲得高濃度的病毒。本發(fā)明的方法，收獲的病毒原液中宿主細(xì)胞成分含量低，血清成分含量低，且病毒培養(yǎng)的第一代結(jié)束后，將感染了病毒的細(xì)胞與未感染病毒的細(xì)胞混合，并傳至新的培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行持續(xù)性的感染培養(yǎng)，不經(jīng)細(xì)胞凍存復(fù)蘇，培養(yǎng)周期快，每代可連續(xù)收獲多次血清濃度低的病毒液，耗時(shí)短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種病毒的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

為確保動(dòng)物來源產(chǎn)品的安全性，國家相關(guān)法規(guī)要求需對(duì)產(chǎn)品的純化生產(chǎn)工藝進(jìn)行病毒清除滅活驗(yàn)證，通過加入模型病毒證明工藝可以清除或滅活一定對(duì)數(shù)值的病毒，即在病毒清除、滅活步驟將病毒摻入到樣本中進(jìn)行滅活，再用指示細(xì)胞檢測(cè)具感染性病毒的變化值，或其他檢測(cè)手段檢測(cè)樣品中病毒的殘余量。(Points to Consider in theManufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use,1997),(Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to ProduceBiologicals,1993),(ICH Q5A(R1)

摻入到樣本中的病毒需滿足兩個(gè)條件，一是病毒中雜質(zhì)含量低，以排除在感染性測(cè)試中非病毒可能導(dǎo)致的干擾、毒性，二是具感染性的病毒滴度高(大于7.0log10)，以滿足病毒清除滅活要求的病毒對(duì)數(shù)下降值。

模型病毒之一，逆轉(zhuǎn)錄病毒，為RNA包膜病毒，生產(chǎn)常用的細(xì)胞為Mus dunni細(xì)胞和mink lung細(xì)胞(M R Lander,S K Chattopadhyay.A Mus dunni cell line that lackssequences closely related to endogenous murine leukemia viruses and can beinfected by ectropic,amphotropic,xenotropic,and mink cell focus-formingviruses.J Virol.1984November；52(2):695–698.)。也有報(bào)道使用CHO細(xì)胞(Rong Ma,Ming-Gang Bi,Xiao-Lan Cui.Growth curve of murine xenotropic leukemia virus-related virus grown in Chinese hamster ovary cells.Journal of the ChineseMedical Association.2014January；77(1):44-48.)，(一種病毒原液的制備方法(申請(qǐng)?zhí)枺篊N201810584021))。用CHO細(xì)胞生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒導(dǎo)致細(xì)胞病變，導(dǎo)致病毒收獲液中宿主細(xì)胞成分、及血清蛋白高，增加病毒濃縮純化難度，病毒液中復(fù)雜的成分將對(duì)病毒清除驗(yàn)證中造成干擾。采用mink lung細(xì)胞、Mus dunni細(xì)胞，目前尚未建立持續(xù)性感染培養(yǎng)體系，難以持續(xù)獲得大量病毒液，滿足工業(yè)化的病毒清除驗(yàn)證對(duì)病毒的需求量。