[發(fā)明專利]具有對于驗證的靶標(biāo)的二次歸巢激活的趨化因子反應(yīng)性激活的自然殺傷細(xì)胞

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880096201.2
• 申請日: 2018-08-01
• 公開（公告）號: CN112513069A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: N·邵默;L·博伊賽爾;H·克林格曼
• 申請（專利權(quán)）人: 南克維斯特公司
• 主分類號: C07K14/52
• 分類號: C07K14/52;A61K35/17;C07K14/715;A61K39/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 陳文平;徐志明

本文提供了修飾的NK?92細(xì)胞，其包含可操作地連接于啟動子的編碼C?C趨化因子受體7型(CCR7)的核酸。任選地，所述細(xì)胞進一步包含編碼C?C基序配體21(CCL21)的核酸、編碼C?C基序配體19(CCL19)的核酸或其組合。還提供了包含修飾的NK?92細(xì)胞的組合物和試劑盒。提供了制備修飾細(xì)胞的方法和使用所述細(xì)胞治療癌癥的方法。

背景技術(shù)

基于過繼轉(zhuǎn)移的腫瘤特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的癌癥免疫療法有望用于患有惡性腫瘤患者的治療。盡管這種療法在某些癌癥中取得了早期成功，但腫瘤的治療仍然是一個挑戰(zhàn)，主要是由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性質(zhì)。除了修飾的T細(xì)胞外，正在探索基于NK細(xì)胞的免疫療法。NK-92是一種細(xì)胞溶解性癌細(xì)胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受試者的血液中發(fā)現(xiàn)的，并隨后離體永生化。NK-92細(xì)胞源自NK細(xì)胞，但缺乏正常NK細(xì)胞呈現(xiàn)的主要抑制性受體，同時保留了大部分激活受體。然而，NK-92細(xì)胞不攻擊正常細(xì)胞，也不會在人體中引起無法接受的免疫排斥反應(yīng)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的常見驅(qū)動因素是缺氧驅(qū)動的CCR7上調(diào)，CCR7是一種主要存在于原始T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的趨化因子受體。先前已經(jīng)證明了血液NK細(xì)胞上的CCR7受體的上調(diào)改善NK細(xì)胞向淋巴結(jié)的歸巢，使它們遵循作為轉(zhuǎn)移性擴散的共同途徑的相同路徑至淋巴結(jié)區(qū)室，但尚未在臨床上相關(guān)的細(xì)胞系中得到證明。

發(fā)明內(nèi)容

本文提供了修飾的NK-92細(xì)胞，其包含可操作地連接于啟動子的編碼C-C趨化因子受體7型(CCR7)的核酸。任選地，細(xì)胞還包含編碼C-C基序配體21(CCL21)的核酸、編碼C-C基序配體19(CCL19)的核酸或其組合。還提供了包含修飾的NK-92細(xì)胞的組合物和試劑盒。提供了制備修飾的細(xì)胞的方法和使用該細(xì)胞治療癌癥的方法。

一個或多個實施方式的細(xì)節(jié)在附圖和以下描述中闡述。根據(jù)說明書和附圖以及根據(jù)權(quán)利要求書，其他特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。

附圖說明

圖1是示意圖，顯示了NK-92細(xì)胞中用于在AAVS1基因座處插入的含有CCR7受體的質(zhì)粒pNKAT-CCR7-LP3。

圖2是示意圖，顯示了將用于通過替代圖1質(zhì)粒的第一插入的嘌呤霉素選擇盒將NFAT反應(yīng)性CCL21基因順序整合到NK-92細(xì)胞中的質(zhì)粒pCRENFAT-CCL21。

圖3是顯示了野生型NK-92細(xì)胞中和表達(dá)CCR7的修飾的NK-92細(xì)胞中與NK-92細(xì)胞相關(guān)的表型標(biāo)志物的表達(dá)的圖。(泳道1：aNK(野生型)；泳道2：修飾的NK-92細(xì)胞(MA3)；泳道3：修飾的NK-92細(xì)胞(MB4)；泳道4：修飾的NK-92細(xì)胞(MB6)；泳道5：修飾的NK-92細(xì)胞(ME6)；泳道6：修飾的NK-92細(xì)胞(MH3)；A：同種型(APC)；B：CD54(ICAM-1)；C：NKp30；D：NKG2D)。

圖4是顯示了表達(dá)CCR7的修飾NK-92細(xì)胞對K562細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的圖。

圖5是顯示了表達(dá)CCR7的修飾NK-92細(xì)胞對HL-60細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的圖。

圖6A和6B是顯示了在靶向結(jié)合K562和Sup-B15的情況下證明的NFAT激活的圖(在細(xì)胞用CD19-CAR的mRNA電穿孔時)。

圖7是顯示了表達(dá)CCR7的修飾NK-92細(xì)胞朝向趨化因子CCL19和CCL21遷移的圖。

圖8是顯示了表達(dá)CCR7的細(xì)胞朝向表達(dá)CCL19的K-19細(xì)胞遷移的圖。

圖9A和9B是顯示CCR7遷移的體內(nèi)分析的圖。圖9A顯示了給藥表達(dá)CCR7的NK-92細(xì)胞后3小時歸巢至具有CCL19的腫瘤的明顯提高。圖9B顯示了在24小時時，四只小鼠中的三只中表達(dá)CCR7的NK-92細(xì)胞至分泌CCL19的腫瘤的募集增加。