[發明專利]一種獲得單細胞mRNA序列的方法

有效

• 申請號: 201880083669.8
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN111801428B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 范飛;程小芳;章文蔚;汪為茂;崔路漫;王歐
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發明公開了一種獲得單細胞mRNA序列的方法。本發明的方法：(1)利用細胞標簽載體捕獲細胞的mRNA，反轉錄得到具有細胞標簽的cDNA；來自于同一個細胞的cDNA具有相同的細胞標簽，來自于不同細胞的cDNA具有不同的細胞標簽；(2)利用轉座酶復合體和分子標簽載體，得到具有分子標簽的多個cDNA片段；來自于同一cDNA的各個片段具有相同的分子標簽，來自于不同cDNA的片段具有不同的分子標簽；(3)高通量測序；(4)根據分子標簽進行序列拼接，得到每個mRNA的序列；根據細胞標簽，得到每個單細胞的所有mRNA的序列。本發明提供的方法可用于高通量獲得大量單細胞中每個單細胞的所有mRNA的序列。

技術領域

本發明涉及一種獲得單細胞mRNA序列的方法。

背景技術

多細胞生物，顧名思義由多種細胞組成。在多細胞生物中，每種細胞類型均有自己獨特的功能，這些具有不同功能的細胞聚合起來，共同構成了組織與器官，并最終作為一個整體定義了多細胞生命。每種細胞的譜系及其發育狀態決定了它們與其他細胞，及其周邊微環境的相互作用。不僅如此，即使分類在同一亞細胞類型中的不同細胞間也有極大可能存在遺傳異質性。

大部分單細胞測序的原初動力來自于癌癥研究，因為癌癥發生發展過程中不同細胞之間體現了高度遺傳特異性，加之腫瘤樣品取樣存在一定困難，難免會有正常細胞混入其中，因此對單個細胞進行分別研究具有重要意義。但隨著技術的發展，如今單細胞測序技術已經被廣泛用于解析復雜生物學系統和過程，例如中央神經系統，免疫系統和哺乳動物發育過程。盡管目前在單細胞層面對組織和器官的生物學功能的了解仍然不甚清晰，但單細胞測序和相關分析技術仍提供了一窺未來的可能。

除此以外，單細胞測序還為鑒定那些難于進行體外分離培養的細胞或生物提供了可靠手段。單細胞測序技術的發展改善了傳染性疾病、食物傳播以及具有抗藥性的微生物病原體的檢測準確性和靈敏度，同時為環境或腸道微生物多樣性分析提供了解決方案。

近年來高通量測序技術發展迅速，該技術以其高準確性和特異性成為了單細胞DNA/RNA測序的最佳選擇。早年的單細胞技術依賴于顯微操作或流式細胞儀，因此通量較低。近期出現的結合微流控平臺和油包水技術方法將單細胞mRNA測序的檢測細胞通量提升到了一個非常客觀的數量級，但均無法對mRNA的全長進行測序，因此無法檢測mRNA的可變剪切或基因融合，微流控芯片對于控制設備有一定要求，因此限制了該技術應用的進一步拓展。

單細胞轉錄本測序最早起源于單細胞mRNA實時定量PCR(qPCR)檢測技術，后者確定了轉錄本擴增的技術基礎。之后隨著高通量測序平臺的不斷發展，單細胞轉錄本測序技術也隨之興起。最早的單細胞分離方案依賴口吸管將單細胞從細胞群體中分離出來，對實驗人員要求高，處理細胞通量低，但能夠進行全長轉錄本的檢測。后續又有研究人員開發出了基于激光顯微切割的單細胞分離方法，需要昂貴設備支持，同時切割的細胞活性會受到一定程度損傷，影響下游實驗結果。隨后利用流式細胞術進行單細胞分選的方法也被開發出來，與激光顯微切割方法類似，同樣需要昂貴設備支持同時分選會對細胞活性有一定影響。之后Fluidigm公司推出了C1單細胞測序系統，該方法利用Fluidigm的微流控芯片將細胞捕獲至特殊的小室中，從而實現單細胞分離的效果，Fluidigm?C1系統價格較高(800美金/每次運行)，同時單細胞處理通量為96個細胞/每次運行，因此不具成本優勢，Fluidigm計劃升級該系統至384個細胞/每次運行、但相應成本也在增加。2015年出現了基于微流控/油包水液滴和帶有細胞標簽的載體的單細胞分離方法，極大提升了一次可以處理的單細胞數量，但由于載體上攜帶的細胞標簽與進行逆轉錄oligo?dT是綁定在一起的，因此在二代測序的短讀長限制下，使用微流控/油包水液滴的方案進行單細胞mRNA測序只能檢測mRNA的3‘端尾巴，無法對全長mRNA進行測序。

發明公開

本發明提供了一種獲得單細胞mRNA序列的方法。

本發明提供了一種獲得單細胞mRNA序列的方法，包括如下步驟：