[發(fā)明專利]一種獲得單細(xì)胞mRNA序列的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880083669.8
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN111801428B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范飛;程小芳;章文蔚;汪為茂;崔路漫;王歐
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

1.一種獲得單細(xì)胞mRNA序列的方法，包括如下步驟：

（1）利用細(xì)胞標(biāo)簽載體捕獲細(xì)胞的mRNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到具有細(xì)胞標(biāo)簽的cDNA；所述細(xì)胞標(biāo)簽載體為攜帶細(xì)胞標(biāo)簽的固相載體；來自于同一個細(xì)胞的cDNA具有相同的細(xì)胞標(biāo)簽，來自于不同細(xì)胞的cDNA具有不同的細(xì)胞標(biāo)簽；

（2）利用轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體和分子標(biāo)簽載體，得到具有分子標(biāo)簽的多個cDNA片段；來自于同一cDNA的各個片段具有相同的分子標(biāo)簽，來自于不同cDNA的片段具有不同的分子標(biāo)簽；分子標(biāo)簽載體為攜帶分子標(biāo)簽的固相載體；

（3）高通量測序；

（4）測序結(jié)果根據(jù)分子標(biāo)簽進(jìn)行序列拼接，得到每個mRNA的序列；進(jìn)一步根據(jù)細(xì)胞標(biāo)簽，得到每個單細(xì)胞的所有mRNA的序列；

其中，所述細(xì)胞標(biāo)簽載體是將多條DNA分子乙連接至固相載體表面得到的；DNA?分子乙為部分雙鏈結(jié)構(gòu)，由兩條部分互補(bǔ)的單鏈?DNA?分子組成，所述DNA?分子乙中具有細(xì)胞標(biāo)簽和mRNA捕獲區(qū)；

所述分子標(biāo)簽載體是將多條DNA分子甲連接至固相載體表面得到的；DNA?分子甲為部分雙鏈結(jié)構(gòu)，由兩條部分互補(bǔ)的單鏈DNA分子組成，所述DNA分子甲中具有分子標(biāo)簽和轉(zhuǎn)酶復(fù)合體捕獲區(qū)。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

在步驟（1）和步驟（2）之間包括富集目標(biāo)物的步驟；

和/或

在步驟（2）和步驟（3）之間包括富集目標(biāo)物的步驟。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：

步驟（1）和步驟（2）之間的富集目標(biāo)物的步驟，為PCR擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增。

4.一種獲得單細(xì)胞mRNA序列并定量的方法，包括如下步驟：

（1）利用細(xì)胞標(biāo)簽載體捕獲細(xì)胞的mRNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到具有細(xì)胞標(biāo)簽和轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽的cDNA；所述細(xì)胞標(biāo)簽載體為攜帶細(xì)胞標(biāo)簽和轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽的固相載體；來自于同一細(xì)胞的cDNA具有相同的細(xì)胞標(biāo)簽，來自于不同細(xì)胞的cDNA具有不同的細(xì)胞標(biāo)簽；來自于同一細(xì)胞的各個cDNA具有不同的轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽；

（2）利用轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體和分子標(biāo)簽載體，得到具有分子標(biāo)簽的多個cDNA片段；來自于同一cDNA的各個片段具有相同的分子標(biāo)簽，來自于不同cDNA的片段具有不同的分子標(biāo)簽；分子標(biāo)簽載體為攜帶分子標(biāo)簽的固相載體；

（3）高通量測序；

（4）測序結(jié)果根據(jù)分子標(biāo)簽進(jìn)行序列拼接，得到每個mRNA序列；進(jìn)一步根據(jù)細(xì)胞標(biāo)簽，得到每個單細(xì)胞的所有mRNA的序列；最后根據(jù)mRNA序列相同但轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽不同的序列數(shù)量，對每個單細(xì)胞的mRNA進(jìn)行定量；

其中，所述細(xì)胞標(biāo)簽載體是將多條DNA分子乙連接至固相載體表面得到的；DNA分子乙為部分雙鏈結(jié)構(gòu)，由兩條部分互補(bǔ)的單鏈DNA分子組成；所述DNA分子乙中具有細(xì)胞標(biāo)簽、轉(zhuǎn)錄本標(biāo)簽和mRNA捕獲區(qū)；

所述分子標(biāo)簽載體是將多條DNA分子甲連接至固相載體表面得到的；DNA分子甲為部分雙鏈結(jié)構(gòu)，由兩條部分互補(bǔ)的單鏈DNA分子組成；所述DNA分子甲中具有分子標(biāo)簽和轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體捕獲區(qū)。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：

在步驟（1）和步驟（2）之間包括富集目標(biāo)物的步驟；

和/或

在步驟（2）和步驟（3）之間包括富集目標(biāo)物的步驟。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：

步驟（1）和步驟（2）之間的富集目標(biāo)物的步驟，為PCR擴(kuò)增或滾環(huán)擴(kuò)增。