[發(fā)明專利]制備分離基質(zhì)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880082451.0
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN111511467A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: G.羅德里格;M.安德爾;R.帕姆格倫;T.比約克曼
• 申請（專利權(quán)）人: 通用電氣醫(yī)療集團生物工藝研發(fā)股份公司
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01J20/32;C07K1/22
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

一種制備分離基質(zhì)的方法，包括以下步驟：a)提供固體載體和衍生自免疫球蛋白?結(jié)合細菌蛋白的堿穩(wěn)定性配體；b)使所述堿穩(wěn)定性配體與所述固體載體反應(yīng)以形成具有共價偶聯(lián)的堿穩(wěn)定性配體的分離基質(zhì)；和c)用包含至少10 mM的堿金屬氫氧化物的洗滌溶液洗滌所述具有共價偶聯(lián)的堿穩(wěn)定性配體的分離基質(zhì)。

發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及制造親和分離基質(zhì)，和特別地涉及制造包含共價連接的配體的親和分離基質(zhì)，所述配體衍生自細菌免疫球蛋白-結(jié)合蛋白，例如葡萄球菌屬(Staphylococcus)蛋白A(SpA)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)蛋白L (PpL)或鏈球菌屬(Streptococcus)蛋白G (SpG)。本發(fā)明特別涉及制造包含這些免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的堿穩(wěn)定性變體的基質(zhì)。

發(fā)明背景

最重要的新藥類型之一是治療性單克隆抗體(mAb)。在這些的制造中，在包含共價偶聯(lián)的葡萄球菌屬蛋白A (SpA)或SpA的變體的基質(zhì)上的親和色譜最普遍用作第一分離步驟以除去大多數(shù)源自包含mAb的細胞培養(yǎng)肉湯的污染物。關(guān)于最終mAb產(chǎn)品的純度要求很高，并且重要的是來自基質(zhì)的SpA配體的任何泄漏被最小化，以避免必須通過后續(xù)的色譜步驟除去泄漏的配體。這樣的步驟已經(jīng)描述于例如US6121428、US7223848、US7847071、US20080312425、US8053565和US7714112，其通過引用以其整體并入本文。減少在使用過程中從基質(zhì)泄漏的配體的量的方法公開于US7485704、US7589183和US20030148540，其也通過引用以其整體并入本文。

SpA是細菌免疫球蛋白-結(jié)合蛋白(IBP)的類型的成員，如通過E V Sidorin和T FSoloveva在Biochemistry (Moscow), vol. 76, no. 3, p. 295-308 (2011)中綜述的。如上所論述的，SpA是用于全抗體的親和色譜的最常見的IBP，這是由于其高度選擇性結(jié)合完整免疫球蛋白的Fc部分。然而，也存在開發(fā)缺少Fc部分的抗體片段和其它抗體構(gòu)建體的強趨勢。在該情況下，使用結(jié)合Fc部分以外的其它部分的IBP，最特別地是結(jié)合κ-型IgG的輕鏈的大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L (PpL)和結(jié)合Fab片段的重鏈的鏈球菌屬蛋白G (SpG)。

在具有IBP配體例如SpA、PpL或SpG的親和分離基質(zhì)的制造中，固體載體，例如多孔的載體顆粒，通常被活化以產(chǎn)生能夠與IBP配體反應(yīng)的基團，和活化的載體顆粒然后與IBP配體反應(yīng)以實現(xiàn)所需的共價偶聯(lián)。然而由于必須應(yīng)用一定過量的配體，基質(zhì)將還包含非共價結(jié)合的配體，其可能是游離溶解的，或者與基質(zhì)物理締合。游離配體是潛在毒性的，和為了除去這些非共價結(jié)合的配體至可忽略或最小泄漏所需的程度，需要大量洗滌操作，這增加制造過程的復(fù)雜性和成本。

因此，需要制造具有IBP配體例如SpA、PpL或SpG的低泄漏的親和分離基質(zhì)的改進方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個方面是提供具有IBP配體例如SpA、PpL或SpG的低泄漏的分離基質(zhì)的有效制造方法。這用包括以下步驟的方法實現(xiàn)：

a) 提供固體載體和堿穩(wěn)定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配體；

b) 使堿穩(wěn)定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配體與固體載體反應(yīng)以形成具有共價偶聯(lián)的堿穩(wěn)定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配體的分離基質(zhì)；和

c) 用包含至少10 mM、例如至少25 mM的堿金屬氫氧化物的洗滌溶液洗滌具有共價偶聯(lián)的堿穩(wěn)定性IBP、蛋白A、蛋白L或蛋白G配體的分離基質(zhì)。堿金屬氫氧化物可以是例如NaOH或KOH或其任何混合物。