[發明專利]MHC多聚體的生產方法

在審

• 申請號: 201880081619.6
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN111936511A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 雅克·雅各布斯·內夫斯;赫伊伯·奧瓦;馬烏戈熱塔·安娜·加斯特卡;喬蓮·約翰娜·盧伊馬斯特羅
• 申請（專利權）人: 萊頓大學醫學中心附屬萊頓教學醫院
• 主分類號: C07K14/74
• 分類號: C07K14/74;G01N33/50;G01N33/569
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 崔巍;張瑩

本發明涉及通過使用溫度介導的肽交換來產生負載有所需肽的MHC多聚體的快速、靈活和有效的方法。該方法可以同時并行用于不同的所需肽。在該方法中，使用條件性肽，該條件性肽在低溫下形成穩定的肽?MHC復合物，但在暴露于限定的提高的溫度時會解離。所得的條件性MHC I復合物和多聚體能夠負載選擇的肽。

發明背景

免疫監視由結合細胞內肽用于呈遞給CD8⁺T淋巴細胞的主要組織相容性I類(MHCI)復合物介導。這種區分自身和外來物的能力是適應性免疫的基礎，且如果沒有這樣做可能導致自身免疫性疾病的發生。在生命中，人類不斷受到病原體(例如病毒)的攻擊。它們中的一些會建立終身感染，其中病毒以潛伏狀態持續存在而不會引起癥狀，但偶爾會重新激活。引起復發性感染的這樣的病毒中的一類是皰疹病毒¹。

通常，重新激活不會導致疾病，因為一旦識別出病毒抗原，感染就會被T細胞迅速清除。但是，在移植的情況下，當患者是免疫妥協的時，皰疹病毒(如巨細胞病毒(CMV)或埃巴病毒(EBV))的重新激活會導致嚴重的健康威脅^2，3。因此，監測移植接受者中的T細胞數量以預測患者是否可能清除感染或是否需要干預是非常重要的。

可以動用適應性免疫系統以使我們受益。在過去的十年中，旨在抑制或增強細胞免疫反應的免疫療法已經取得了巨大的進步。包括針對CTLA-4和PD-1/PD-L1的抗體在內的幾種免疫檢查點抑制劑已被批準用于臨床，并且在包括黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌在內的各種癌癥的治療中顯示出了顯著的響應^4-8。

作為檢查點阻斷的結果，針對新抗原引起的T細胞應答顯著增加，導致改善的癌細胞的殺傷^9，10。針對免疫檢查點的治療方法和癌癥突變組(mutanome)中的信息相結合，在個性化癌癥治療中具有廣闊的前景。因此，識別針對新抗原和有助于免疫治療成功的其他癌癥特異性表位的T細胞應答是至關重要的。

自1996年由Altman等人首次使用以來，MHC多聚體-帶有抗原肽的MHC單體的低聚體-標記有熒光染料對于通過流式細胞術分析和監測抗原特異性T細胞來說，已經是最廣泛使用的試劑¹¹。

但是，多聚體的產生涉及許多耗時的步驟，包括在細菌中表達例如MHC I重鏈和β2-微球蛋白、與所需肽重折疊、純化、生物素化和多聚化¹¹。最初，由于空的MHC I分子是不穩定的，因此必須對每個個體肽-MHC I復合物進行所有這些步驟。

這促使人們尋求尋找生成包括MHC I分子在內的肽接受性MHC分子的方法，以使得隨意地由單個輸入的MHC I-肽復合物并行產生多個MHC多聚體。例如，我們和其他人已經開發了幾種旨在在MHC I上進行肽交換的技術，例如使用高碘酸鹽或連二亞硫酸鹽作為化學觸發劑來原位切割條件性配體，或使用二肽作為催化劑，之后肽殘余物能夠解離并被選擇的肽替代^13-16。

或者，將MHC單體與在UV暴露下裂解的可光裂解的肽重折疊，此后個體肽殘余物解離，空的MHC I分子能夠負載選擇的肽隨后進行多聚化^17-19。這種方法已經促進了無數表位的發現和對相應T細胞的監測^18，20-22。但是，UV交換技術需要使用可光裂解的肽和紫外線光源。UV暴露和配體交換與熒光標記的多聚體不兼容，且生物素化負載肽的MHC I分子需要在交換后在鏈霉親和素上進行多聚化。其他缺點包括在UV介導的裂解下生成反應性亞硝基物質，以及MHC I和/或相關肽的光損傷，而生成的熱量則導致樣品蒸發。