[發明專利]重組多肽中的工程化O-糖基化及其用途

在審

• 申請號: 201880081343.1
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN111479820A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: A.蒂布爾斯;M.帕沃思;D.希加奇;E.羅西;K.A.科扎科夫斯卡;T.V.默里
• 申請（專利權）人: 免疫醫療有限公司
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;C07K9/00;C12P21/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 張宇騰;彭昶

本發明涉及具有工程化的O?連接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)的重組多肽治療劑，該O?連接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)與一個或多個O?聚糖(標簽)共價連接。可在哺乳動物細胞中產生重組O?糖基化多肽，以通過代謝標記呈現天然或非天然的O?聚糖結構。

以電子方式提交的材料通過援引并入

計算機可讀的核苷酸/氨基酸序列表通過援引以其全文并入本文，該序列表隨此同時提交并確定如下：于2017年12月21日創建的、命名為“OGLYC-100-US-PSP-SequenceListing.TXT”的一份11，891字節的ASCII(文本)文件。

技術領域

本發明涉及具有工程化的O-連接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)的重組多肽治療劑，該O-連接的氨基酸(AA)糖基化序列(基序)與一個或多個O-聚糖(標簽)共價連接。可在哺乳動物細胞中產生重組O-糖基化多肽，以通過代謝標記呈現天然或非天然的O-聚糖結構。通過這種方法產生的多肽可受益于工程化O-聚糖結構，這些工程化O-聚糖結構提供了另外的功能性；最顯著的是，可以通過化學綴合向工程化O-聚糖添加功能性部分。

背景技術

蛋白糖基化是常見且高度多樣化的翻譯后修飾(PTM)。在真核細胞中，這樣的修飾可以分為兩大類：N-連接的糖基化和O-連接的糖基化。典型地在細胞外；在N-連接的糖基化中，寡糖共價附接至天冬酰胺，而在O-連接的糖基化中，該附接通常發生在絲氨酸或酪氨酸的羥基上。

由糖基化反應產生的結構存在很大的多樣性，對于在分泌型糖蛋白和細胞表面相關糖蛋白上發現的O-連接的粘蛋白型聚糖而言，這種差異是由留在分泌途徑(特別是高爾基體)中的特異性轉移酶的活性而引起的。它們通過連續的單糖縮合到/超過前體N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc，Tn抗原)來催化O-聚糖的成熟，前體N-乙酰半乳糖胺本身是通過多肽N-乙酰半乳糖胺轉移酶(ppGalNAc-T)同工酶的作用放置的。在聚糖結構本身的水平以及O-聚糖與蛋白骨架的附接位置方面存在多樣性，這些是由O-糖基化序列基序和寡糖轉移酶表達的獨特相互作用以及養分的利用率和細胞活性精巧控制的。目前僅對該過程的細節有模糊的了解。

在自然界中，O-聚糖賦予許多期望的效果，這些效果是由諸如水合/電荷、蛋白-蛋白相互作用、骨架暴露/可及性和表面表位/識別等特性所提供的。例如，多肽中O-聚糖的存在可以賦予諸如屏障/潤滑(一同地)、延長的半衰期(蛋白酶/降解抗性)、活性減弱(蛋白運輸、受體信號傳導)和蛋白折疊/聚集狀態等特征。非天然O-聚糖可以提供進一步的期望性質。例如，多肽中O-聚糖的存在可以賦予改善的藥物行為，諸如配制、延長半衰期或改變免疫原性。在進一步的進展中，還可以利用對多肽中非天然O-聚糖組成(或位置)的工程化。例如，接受后續化學反應，諸如點擊化學綴合。在工程化治療性多肽中可以利用許多這些特性。

可以向多肽中引入O-連接的糖基化以利用O-聚糖的一種或多種特性。然而，并非所有的多肽都具有O-連接的糖基化序列作為其氨基酸序列的一部分。另外，現有的O-連接的糖基化序列的O-糖基化可能無法有效地進行，和/或通過現有的O-連接的糖基化序列的糖基化而呈現的O-聚糖可能不是最適于利用的。因此，需要將O-糖基化位點工程化到多肽中。

US 9,187,532涉及將外源糖基化位點并入諸如BMP-7、NT-3和FGF-21等蛋白中。根據US 9,187,532的方法，在大腸桿菌(E.coli)細胞中表達具有外源O-連接的糖基化序列的突變蛋白，并將其純化。隨后，通過將GalNAc體外添加到純化蛋白中來嘗試糖基化。