[發(fā)明專利]被檢樣品中的細(xì)菌數(shù)的定量方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880080998.7
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN111684067A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 仁井見英樹;北島勛;宮腰晃央;東祥嗣
• 申請（專利權(quán)）人: 三井化學(xué)株式會社;國立大學(xué)法人富山大學(xué)
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12Q1/689
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 楊宏軍

本發(fā)明的課題在于提供能夠使用PCR法迅速且精度良好地定量被檢樣品中的細(xì)菌菌數(shù)的方法。作為解決上述課題的方法，利用以下的工序進(jìn)行被檢樣品中的細(xì)菌的鑒定及定量。(1)第一PCR工序，以來源于被檢樣品的核酸作為模板，使用用于擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因的通用引物對，利用PCR法得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)第二PCR工序，使用用于擴(kuò)增利用前述第一PCR工序得到的第一擴(kuò)增產(chǎn)物所具有的序列的內(nèi)部序列的引物對，利用巢式PCR法得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物；以及(3)菌數(shù)定量工序，使用校準(zhǔn)用的數(shù)據(jù)，從由前述第二PCR工序得到的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的量求出前述被檢樣品中的細(xì)菌數(shù)。另外，也可以在上述的工序(1)～(3)的基礎(chǔ)上追加以下的工序(4)及(5)。(4)菌種鑒定工序，對前述被檢樣品中的細(xì)菌的菌種進(jìn)行鑒定。(5)細(xì)菌數(shù)校正工序，以由前述菌數(shù)定量工序求出的細(xì)菌數(shù)作為暫定細(xì)菌數(shù)，基于前述對照細(xì)菌及由前述菌種鑒定工序鑒定出的菌種的16S rRNA操縱子拷貝數(shù)來校正暫定細(xì)菌數(shù)，從而確定前述被檢樣品中的細(xì)菌數(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用PCR法迅速且精度良好地進(jìn)行被檢樣品、特別是血液被檢樣品中的細(xì)菌數(shù)的定量、或者細(xì)菌數(shù)的定量及細(xì)菌菌種的鑒定的方法。

背景技術(shù)

敗血癥的重癥度判定中所使用的傳統(tǒng)檢查項目為血液培養(yǎng)、內(nèi)毒素、降鈣素原、白細(xì)胞數(shù)、CRP(C-reactive protein，C-反應(yīng)蛋白)、血壓、體溫、呼吸數(shù)、脈搏數(shù)等，最近新增加了Presepsin(可溶性CD14亞型，sCD14-ST)。由于血液培養(yǎng)結(jié)果需要時間，因此難以反饋到早期治療中。由于白細(xì)胞數(shù)、CRP是宿主側(cè)的感染防御反應(yīng)，因此檢查值與重癥度產(chǎn)生時間差，常常成為與實際的重癥度背離的值。降鈣素原在特異性、定量性方面存在困難，從而難以應(yīng)用。Presepsin無法用于腎功能障礙的患者。這樣一來，作為實時地反映感染癥的重癥度、治療效果的指標(biāo)，還不存在值得信賴的檢查項目。如果可能，以患者被檢樣品中的菌數(shù)作為生物標(biāo)記而用作感染癥重癥度的判定或監(jiān)測治療效果的指標(biāo)是最直接的，也是合理的。

目前，被檢樣品中的菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)定量分析通過培養(yǎng)所采集的患者被檢樣品來進(jìn)行，但只是非常粗略的定量(僅分類為“1+”、“2+”、“3+”)。培養(yǎng)技術(shù)雖然被長年利用，但是檢查耗費時間(通常為2～3天)，而且依賴于每個菌種不同的增殖能力，因此使用菌落形成單位(Colony-forming unit，CFU)的定量結(jié)果的可靠性低。因此，為了進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的正確測定，優(yōu)選不依賴于培養(yǎng)的測定法。近年來，認(rèn)為在除培養(yǎng)以外的方法中通用性最高的技術(shù)是定量PCR(實時PCR)法。

嘗試?yán)脤崟rPCR法對患者被檢樣品中的致病菌進(jìn)行定量的情況下，在檢查開始的時刻不鑒定致病菌，另外，混合感染也可能經(jīng)常發(fā)生，因此需要使用細(xì)菌通用引物(bacterial universal引物)(其是檢測幾乎所有細(xì)菌的引物，以下有時簡單記載為“通用引物”。)。但是，患者被檢樣品中的致病菌常常是少量的，因此有時在通常的實時PCR中不能達(dá)到足以正確定量的充分的靈敏度。另外，即使得到充分的靈敏度，在細(xì)菌通用PCR(bacterial universal PCR)(其為檢測幾乎所有細(xì)菌的PCR)中也會存在污染容易被檢測的問題，在致病菌的判定中產(chǎn)生困難。其結(jié)果為：患者被檢樣品中的致病菌的定量檢查盡管對于感染癥治療非常有用，但是因技術(shù)上未解決的問題而還未達(dá)到實用化。

關(guān)于利用PCR法的感染癥病原菌的鑒定方法，在專利文獻(xiàn)1中公開了下述感染癥病原菌的迅速鑒定方法：使用來源于被檢樣品的核酸，使用多個特定引物組進(jìn)行實時PCR，并使用所得的多個擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對被檢樣品中的菌進(jìn)行鑒定。

在專利文獻(xiàn)2中公開了可實現(xiàn)檢測靈敏度提高的真核生物生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶和基于使用了該耐熱性DNA聚合酶的PCR法的細(xì)菌菌種的鑒定方法。

在專利文獻(xiàn)3中公開了如下用途的多個引物對：使用來源于被檢樣品的核酸進(jìn)行實時PCR，使用所得的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)對被檢樣品中的菌進(jìn)行鑒定。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)