[發明專利]被檢樣品中的細菌數的定量方法

在審

• 申請號: 201880080998.7
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN111684067A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 仁井見英樹;北島勛;宮腰晃央;東祥嗣
• 申請（專利權）人: 三井化學株式會社;國立大學法人富山大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12Q1/689
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 楊宏軍

1.對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(1)第一PCR工序，以來源于被檢樣品的核酸作為模板，使用細菌的16S rRNA基因的擴增用通用引物對，利用PCR法得到第一擴增產物；

(2)第二PCR工序，使用用于對通過所述第一PCR工序得到的第一擴增產物所具有的序列的內部序列進行擴增的引物對，利用巢式PCR法得到第二擴增產物；以及

(3)菌數定量工序，使用表示來源于菌種已知的對照細菌的擴增產物的量與所述對照細菌的細菌數的關系的校準用的數據，由通過所述第二PCR工序得到的第二擴增產物的量求出所述被檢樣品中的細菌數。

2.如權利要求1所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：

(A)第一PCR工序，以來源于被檢樣品的核酸作為模板，使用細菌的16S rRNA基因的擴增用通用引物對，利用PCR法得到第一擴增產物；

(B)第二PCR工序，使用用于對通過所述第一PCR工序得到的第一擴增產物所具有的序列的內部序列進行擴增的引物對，利用巢式PCR法得到第二擴增產物；

(C)第三PCR工序，使用與菌種已知的對照細菌的已知細菌數對應的核酸試樣，利用PCR法得到第三擴增產物；

(D)第四PCR工序，使用通過所述第三PCR工序得到的第三擴增產物，利用巢式PCR法得到第四擴增產物；

(E)由所述已知的菌數和所述第四擴增產物的量制作校準用的數據的工序；以及

(F)菌數定量工序，使用所述校準用的數據，由通過所述第二PCR工序得到的第二擴增產物的量求出所述被檢樣品中的細菌數。

3.如權利要求2所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其中，通過以下的工序進行所述工序(C)、(E)及(F)：

(C-1)第三PCR工序，分別使用與菌種已知的對照細菌的不同的多個已知細菌數對應的多個核酸試樣，利用PCR法得到第三擴增產物；

(E-1)從所述已知的菌數和所述第四擴增產物的量制作校準曲線的工序；以及

(F-1)菌數定量工序，使用所述校準曲線，由通過所述第二PCR工序得到的第二擴增產物的量求出所述被檢樣品中的細菌數。

4.如權利要求1～3中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，以所述第一PCR工序中的基因擴增未到達平臺期的循環數進行所述第一PCR工序。

5.如權利要求1～4中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，具有將包含所述第一擴增產物的反應液進行稀釋而供于所述第二PCR工序的稀釋工序。

6.如權利要求2～5中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，在同一PCR裝置內同時進行所述第一PCR工序和所述第三PCR工序，并且在同一PCR裝置內同時進行所述第二PCR工序和所述第四PCR工序。

7.如權利要求1～6中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，還具有下述工序：分別使用多個引物對進行第二PCR工序，基于經各引物對所擴增的多個擴增產物的熔解溫度(Tm值)的組合或Tm值間的差值的組合，對所述被檢樣品中的細菌的菌種進行鑒定。

8.如權利要求7所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，使用所述第二PCR工序用的多個引物對中的至少1者進行所述第四PCR工序(其中，在使用多個引物對的情況下，分別使用多個引物對進行第四PCR工序)。

9.如權利要求1～8中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，其特征在于，所述對照細菌為大腸桿菌。

10.如權利要求1～9中任一項所述的對被檢樣品中的細菌數進行定量的方法，在所述第一PCR工序中使用的通用引物對中，正向引物、反向引物中的一者或兩者為等量地混合有1個堿基不同的2種引物而成的。