[發明專利]具有光致發光的非常規和/或反向變化的數字擴增試驗

在審

• 申請號: 201880078902.3
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN111433372A
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: E·A·赫夫納;D·瑪爾
• 申請（專利權）人: 生物輻射實驗室股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張靜;陳揚揚

本發明提供了使用數字擴增試驗進行分析的方法和組合物，具有在光致發光中的非常規/反向變化以指示一種或多種靶標的存在。在示例性方法中，可以形成獨立樣份，其僅一個子集包含靶標。每個樣份可包括具有標記物的探針，具有猝滅劑并被配置為與探針雜交以猝滅標記物的接收物，以及被配置為與探針和/或接收物雜交以阻斷接收物與探針雜交的分隔物。可以在樣份中進行擴增反應以產生對應于靶標的擴增子。分隔物可以與擴增子雜交，并且可以通過擴增反應而延伸或降解?？梢詸z測來自樣份的標記物的光致發光，并且靶標陽性樣份的光致發光可以小于靶標陰性樣份的光致發光。

在先申請的交叉引用

本申請基于2017年10月19日提交的美國臨時專利申請序列號62/574,694并根據35U.S.C.§119(e)要求其權益，該申請通過引用全部納入本文用于所有目的。

對其他材料的交叉引用

本申請通過引用整體方式并入以下材料用于所有目的：2006年5月9日授權的美國專利號7,041,481；2010年7月8日公開的美國專利申請公開號2010/0173394A1；2012年12月20日公開的美國專利申請公開號2012/0322058A1；2013年2月14日公開的美國專利申請公開號2013/0040841A1；2015年5月28日公開的美國專利申請公開號2015/0148250A1；以及Joseph R.Lakowicz，《熒光光譜原理》(Principles of Fluorescence Spectroscopy)(第2版，1999年)。

導言

數字擴增試驗可以定量樣品中的核酸靶標(靶序列)。在典型的數字試驗中，在靶標被部分占據時，樣品被分成一個集合的獨立樣份，例如液滴。靶標的拷貝隨機存在于樣份中，只有一個子集的樣份包含至少一個拷貝的靶標。每個樣份都配制為包含相同集合的擴增試劑，用于通過擴增反應(例如PCR)進行靶標依賴性生成產物。每個個體樣份中還包括具有熒光標記的探針，以指示在每個單獨樣份中是否已經發生了靶標依賴性擴增反應。在進行反應之后，例如通過使樣份熱循環，可以檢測每個樣份中標記物的熒光。然后根據熒光強度將個體樣份分類為靶標陽性或陰性。然后可以基于靶標陽性(或陰性)的樣份數和總樣份數(靶標陽性和陰性)通過泊松統計來計算樣品中靶標的濃度。

多重數字試驗可以用相同集合的樣份定量兩種或更多種不同的靶標。每個樣份可包含靶標特異性探針，每個探針對應于不同的靶標并具有光譜上可區分的標記物。通過使用相同的熒光標記物在可區分的熒光特征強度下來報告兩種或更多種不同靶標的擴增，可以進一步提高靶標多路復用(multiplexing)的水平。例如，對于第一靶標呈陽性的樣份可以顯示出與靶標陰性樣份相比標記物的熒光強度較小的增加，而對于第二靶標呈陽性的樣份可以顯示出較大的熒光強度增加。但是，這種基于強度的多路復用的缺點是，不同靶標的特征強度可能取決于試驗條件，因此每次進行試驗時都可能相對于彼此有些偏移。這些變化會使分析的穩健性和準確性降低。

需要一種用于進行多重數字試驗的新方法，該方法具有更多用于調節熒光強度的選項。

發明內容

本公開提供了使用數字擴增試驗進行分析的方法和組合物，具有光致發光的非常規/反向變化以指示一種或多種靶標的存在。在示例性方法中，可以形成獨立樣份，其僅一個子集包含靶標。每個樣份可包括具有標記物的探針，具有猝滅劑并被配置為與探針雜交以猝滅標記物的接收物(sink)，以及被配置為與探針和/或接收物雜交以阻斷接收物與探針雜交的分隔物(separator)?？梢栽跇臃葜羞M行擴增反應以產生對應于靶標的擴增子。分隔物可以與擴增子雜交，并且可以通過擴增反應而延伸或降解。可以檢測來自樣份的標記物的光致發光，并且靶標陽性樣份的光致發光可以小于靶標陰性樣份的光致發光。

附圖說明