[發明專利]酶法合成寡核苷酸的方法和體系

在審

• 申請號: 201880078052.7
• 申請日: 2018-10-01
• 公開（公告）號: CN111542532A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 肯德爾·霍夫;米歇爾·哈爾佩因;詹卡洛·加爾巴尼亞蒂;周巍
• 申請（專利權）人: 生捷科技控股公司
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00;C07H21/02;C07H21/04;C12N9/10;C12N9/12;C12N9/22
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 武晶晶

1.一種合成單鏈寡核苷酸的方法，包括:

(a)提供包含游離3’端、聚合酶和核苷酸試劑的單鏈引物；以及

(b)通過所述聚合酶用所述核苷酸試劑從所述游離3’端延伸所述單鏈引物；

其中，所述聚合酶需要不超過7個堿基配對來延伸所述單鏈引物。

2.根據權利要求1的方法，其中所述核苷酸試劑是帶有3’端終止子的可逆終止核苷酸。

3.根據權利要求1的方法，其中所述單鏈引物還包括連接至基底的5’-端。

4.根據權利要求1的方法，其中所述聚合酶是一種改性的/改良的/經修飾的聚合酶。

5.根據權利要求2的方法，還包括：

(c)從所述可逆終止核苷酸中移除所述3’端終止子。

6.根據權利要求5所述的方法，還包括：

(d)重復步驟(a)-(c)。

7.根據權利要求5方法，還包括在(b)之后和(c)之前:

(b1)在所述聚合酶或末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)存在下，用雙脫氧核苷酸試劑處理所述單鏈引物。

8.根據權利要求1的方法，還包括在(a)之后和(b)之前：

(a1)將所述單鏈引物上的雜交位點與模板雜交，其中所述雜交位點位于所述3’端，且包含不超過7個堿基。

9.根據權利要求8的方法，其中所述模板是所述單鏈引物、附著于所述基底的相鄰單鏈核酸或溶液中多個單鏈核酸模板中的一種。

10.根據權利要求9的方法，其中所述模板是所述相鄰的單鏈核酸，并且其中所述相鄰單鏈核酸與所述單鏈引物的序列一致性不超過5％、不超過10％、不超過15％、不超過20％、不超過25％、不超過30％、不超過35％、不超過40％、不超過45％、不超過50％、不超過55％、不超過60％、不超過65％、不超過70％、不超過75％、不超過80％、不超過85％、不超過90％或者不超過95％。

11.根據權利要求9的方法，其中所述模板是所述相鄰單鏈核酸，并且其中所述相鄰單鏈核酸與所述單鏈引物具有100％的序列一致性。

12.根據權利要求9的方法，其中所述模板是溶液中的所述多個單鏈核酸模板的成員，并且其中溶液中的所述多個單鏈核酸模板包括多個二聚體、多個三聚體、多個四聚體、多個五聚體、多個六聚體、多個七聚體、多個八聚體、多個九聚體、多個十聚體、多個十一聚體或多個十二聚體。

13.根據權利要求9所述的方法，其中所述多個單鏈核酸模板包含隨機序列。

14.根據權利要求8的方法，其中所述雜交位點包含1、2、3、4、5、6或7個堿基。

15.根據權利要求8的方法，其中，(b)中所述延伸的效率在(a1)中所述模板的存在下得到提高。

16.根據權利要求8的方法，其中所述聚合酶需要1、2、3、4、5、6或7個堿基對來延伸所述單鏈引物。

17.根據權利要求1的方法，其中所述延伸在約20℃至約99℃之間進行。

18.根據權利要求17的方法，其中所述延伸在約50℃至約75℃之間進行。

19.根據權利要求17的方法，其中所述延伸在約55℃至約65℃之間進行。

20.根據權利要求17的方法，其中所述延伸在約60℃下進行。