[發(fā)明專利]酶法合成寡核苷酸的方法和體系在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201880078052.7 | 申請日： | 2018-10-01 |
| 公開（公告）號： | CN111542532A | 公開（公告）日： | 2020-08-14 |
| 發(fā)明（設計）人： | 肯德爾·霍夫;米歇爾·哈爾佩因;詹卡洛·加爾巴尼亞蒂;周巍 | 申請（專利權(quán)）人： | 生捷科技控股公司 |
| 主分類號： | C07H21/00 | 分類號： | C07H21/00;C07H21/02;C07H21/04;C12N9/10;C12N9/12;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京安信方達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262 | 代理人： | 武晶晶 |
| 地址： | 開曼群*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 合成 寡核苷酸 方法 體系 | ||
本發(fā)明涉及在聚合酶存在下由單鏈固定化引物酶法合成寡核苷酸的方法、過程和系統(tǒng)。利用本發(fā)明的方法，在脫氧核糖核苷酸三磷酸或核糖核苷酸三磷酸存在下，可從單鏈固定化引物酶法合成單鏈寡核苷酸。雙脫氧核糖核苷酸三磷酸酯、帶有可逆終止子的脫氧核糖核苷酸三磷酸酯或帶有可逆終止子的核糖核苷酸三磷酸酯可以酶法添加到引物或其延伸產(chǎn)物的末端。根據(jù)本發(fā)明的方法，單鏈引物可與模板結(jié)合，所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)可使聚合酶在3’端延伸引物。
本申請要求2017年10月4日提交的第62/568,205號美國臨時專利申請和2018年9月5日提交的第62/727,174號美國臨時專利申請的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
合成核酸(如寡核苷酸)在分子生物學、法醫(yī)學和醫(yī)學診斷等許多領域發(fā)揮著重要作用。寡核苷酸已成為現(xiàn)代生物技術(shù)和醫(yī)學研究的重要工具。例如，寡核苷酸已被廣泛應用于各種技術(shù)中，包括診斷探測法、聚合酶鏈式反應(PCR)、基因表達的反義抑制和核酸組裝。寡核苷酸合成可能涉及基因組編輯，例如依賴CRISPR、DNAzymes(即通過體外選擇獲得的催化活性脫氧核苷酸(DNA)分子)、DNA折紙、用于數(shù)據(jù)存儲的DNA和空間轉(zhuǎn)錄組學的應用。寡核苷酸的廣泛應用也促進了核酸陣列的發(fā)展，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)陣列。
設計的核酸序列通過使用聚合酶鏈反應(PCR)或連接酶鏈反應(LCR)方法連接相應的(先前合成的)寡核苷酸，一次組裝一個。參見，如Smith等人，“通過全基因組組裝生成合成基因組：合成寡核苷酸的X174噬菌體”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(26):15440-5(2003).Gibson是一種分子克隆方法，它允許在單個等溫反應中連接多個DNA片段。參見，如Gibson等人，“酶法組裝高達幾百千堿基的DNA分子”。Nature Methods.6(5):343–345構(gòu)建長寡核苷酸需要同時合成多個基因序列。然而，最先進的的寡核苷酸合成基本上是通過化學合成逐個完成的。參見Zhou等人，“寡脫氧核苷酸的微流控PicoArray合成和多個DNA序列的同時組裝”，Nucleic Acids Res.,11:32(18):5409-17(2004)。
通過聚合酶催化反應合成單鏈、固定化或液相寡核苷酸是可取的。本發(fā)明提供了通過使用一種酶來完成這種酶合成的方法，該酶需要不超過7個堿基對，即可從游離3’端延伸單鏈、固定寡核苷酸。在一些實施例中，酶法合成需要1、2、3、4、5、6或7個堿基配對，以從其游離3’端延伸單鏈、固定寡核苷酸。本發(fā)明還提供了通過使用改良聚合酶完成這種酶合成的方法，該聚合酶需要不超過7個堿基配對，即可將單鏈式溶液相寡核苷酸從其游離3’端延伸出來。在某些情況下，酶法合成需要1、2、3、4、5、6或7個堿基配對，才能從其游離3’端延伸出單鏈的液相寡核苷酸。
在一個方面，本發(fā)明提供了一種合成單鏈寡核苷酸的方法，包括：(a)提供包含游離3’端、聚合酶和核苷酸試劑的單鏈引物；(b)通過聚合酶將單鏈引物從游離3’端延伸至核苷酸試劑；聚合酶需要不超過7個堿基配對來延伸單鏈引物。
在一些實施例中，所述核苷酸試劑為帶有3’端終止子的可逆終止核苷酸。在一些實施例中，單鏈引物還包括附著于基底的5’端。在一些實施例中，聚合酶是一種改良的聚合酶。在一些實施例中，該方法還包括:(c)從可逆終止核苷酸中去除3’端終止子。在一些實施例中，該方法還包括:(d)重復步驟(a)-(c)。在一些實施例中，(d)中的重復步驟將單鏈引物從游離3’端延伸，從而合成包含該單鏈引物的單鏈寡核苷酸產(chǎn)物。
在一些實施例中，該方法還包括在(b)之后和(c)之前：(b1)在聚合酶或末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)存在的情況下，用雙脫氧核苷酸試劑處理單鏈引物。
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