[發明專利]真皮乳頭和毛囊等同物的體外制備方法

在審

• 申請號: 201880077456.4
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN111417717A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: K.巴卡;T.塞拉圖賴
• 申請（專利權）人: 萊雅公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 張萍;梅黎

1.一種用于體外制備真皮乳頭等同物的方法，該方法包括以下中的至少一個步驟：在包含無血清營養培養基B的支持物上培養成纖維細胞，持續足以使所述成纖維細胞從所述支持物脫離并聚在一起形成至少一個球狀體的時間段，這些成纖維細胞源自真皮乳頭和/或源自結締組織鞘；使用的所述支持物的表面不允許細胞粘附；所述培養支持物選自2D或3D圓底微孔板培養支持物。

2.如權利要求1所述的方法，其中以至少14000個細胞/cm²的密度，優選地以在14000個細胞/cm²與47600個細胞/cm²之間的密度，甚至更好以在23500個細胞/cm²與24500個細胞/cm²之間的密度，將所述成纖維細胞接種在所述2D培養支持物上。

3.如權利要求1所述的方法，其中以至少3000個細胞/cm²的密度，優選地至少9000個細胞/cm²的密度，甚至更好以在9000個細胞/cm²與20000個細胞/cm²之間的密度，將所述成纖維細胞接種在所述3D培養支持物上。

4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述營養培養基B包含500至1500mg/l的氨基酸、2至18mg/l的維生素、1500至4500mg/l的葡萄糖、8750至10000mg/l的無機鹽、2至20μg/ml的胰島素、2至60ng/ml的氫化可的松、以及任選地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌劑。

5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中將所述成纖維細胞培養至少3天，優選地至少4天，甚至更好4天與21天之間。

6.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述支持物的表面是中性的和疏水性的。

7.如權利要求1至6中任一項所述的方法，該方法在培養所述成纖維細胞的步驟之前還包括以下預備步驟：

a.從頭皮樣品中分離出生長期毛囊；

b.通過該真皮乳頭和/或該結締組織鞘的顯微解剖來回收該真皮乳頭和/或該結締組織鞘的成纖維細胞；

c.在由DMEM Glutamax構成的，補充了20％體積的胎牛血清(FCS)、50至90mg/l的非必需氨基酸和任選地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌劑的營養培養基A中，進行所述真皮乳頭成纖維細胞和/或所述結締組織鞘成纖維細胞的擴增。

8.一種體外真皮乳頭等同物，其可通過如權利要求1至7中任一項所述的方法獲得。

9.如權利要求8所述的體外真皮乳頭等同物，其特征在于它具有陽性堿性磷酸酶活性。

10.增殖性上皮細胞和如權利要求8和9中任一項所述的體外真皮乳頭等同物用于制備體外毛囊等同物的用途。

11.一種用于體外制備毛囊等同物的方法，該方法包括以下中的至少一個步驟：在至少一種如權利要求8或9中所定義的真皮乳頭等同物的存在下培養增殖性上皮細胞，持續足以使所述增殖性上皮細胞分化為對標志物K85和K35呈陽性的角質形成細胞的時間段。

12.如權利要求11所述的方法，其中以至少2000個細胞/cm²的密度，優選地至少6000個細胞/cm²的密度，并且甚至更好在6000個細胞/cm²與10000個細胞/cm²之間的密度，將這些增殖性上皮細胞進行接種。

13.如權利要求11或12中所述的方法，其中將這些增殖性上皮細胞培養至少3天，優選地至少5天，甚至更好5天與20天之間。