[發明專利]用于遺傳工程改造克魯維酵母宿主細胞的方法

在審

• 申請號: 201880074362.1
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN111356766A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: Y·茨嘎也
• 申請（專利權）人: 阿邁瑞斯公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;陳揚揚

本文提供了用于遺傳工程改造克魯維酵母(Kluyveromyces)的方法。該方法可以用于遺傳工程改造克魯維酵母以產生和分泌全長抗體或抗體片段。該發明還提供了用于產生和分泌抗體的方法。

發明領域

本文所提供的方法和組合物通常涉及分子生物學和遺傳工程改造領域。

背景技術

將靶向修飾引入宿主細胞基因組的遺傳工程改造技術能夠用于各種領域。根本地，確定基因型如何影響表型取決于引入靶向插入或缺失以削弱或廢除天然基因功能的能力。在合成生物學領域，制造能夠產生感興趣的化合物或蛋白質的遺傳修飾的微生物需要將定制的DNA序列插入宿主細胞的染色體中；工業規模生產通常需要在宿主細胞基因組中引入多個基因。

對于某些宿主細胞，特別是對于常規酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，充分開發了遺傳工具以進行靶向的基因組基因缺失和整合。多種非常規酵母細胞對于工業應用(例如，小分子和蛋白質生產)是有吸引力的宿主。然而，用于工程改造這些物種的工具通常很差。例如，克魯維酵母屬(genus Kluyveromyces)，特別是馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)，因其快速生長，高耐酸性和高溫耐受性，對于生產工業產品和抗體是有吸引力的酵母宿主。然而，由于非同源末端連接(NHEJ)的高基礎(basal)速率以及維持穩定質粒的困難，對馬克斯克魯維酵母進行靶向基因組改變歷來很耗時。最近首次報道了基于CRISPR破壞馬克斯克魯維酵母中的基因，但是沒有整合任何基因并且該破壞依賴于NHEJ。當前，尚未報道過馬克斯克魯維酵母中兆核酸酶介導的，靶向的，單基因組的整合或多重整合。這類整合將極大地將遺傳工程改造周期時間減少至少50％。

特別希望的是使用非常規酵母細胞產生抗體。當前，在中國倉鼠卵巢(CHO)或其他哺乳動物細胞系中制備治療目的的單克隆抗體。經過數十年的細胞系開發和工藝開發，已經實現了在12天內達到最高0.5g/L/天的生產率。從鑒定DNA構建體到提交用于小規模生產的研究用新藥(IND)所需的時間約為15個月。參見Genentech網站。此外，經過數十年的改進，CHO細胞系生產率不太可能顯著提高，并且隨著引進對于更廣泛和慢性病癥(例如，阿爾茨海默氏病)的療法，預期對單克隆抗體的需求將會激增。因此，CHO細胞存在兩個問題：生產新抗體的時間線很長，和滿足未來需求的能力不足。迄今為止，已經通過工程改造的酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(例如，Glycofi，購自Merck)已經產生了具有適當糖基化的全長單克隆抗體。

為了解決這些問題，需要改善用于各種克魯維酵母宿主細胞基因組修飾的當前已知方法。本發明解決了這些和其他需求。

發明內容

本發明提供了用于修飾克魯維酵母宿主細胞基因組中靶位點的方法。該方法包括使具有降低的非同源末端連接(NHEJ)活性的克魯維酵母宿主細胞接觸：編碼核酸酶的核酸，所述核酸酶能夠切割靶位點；和供體DNA分子，其能夠在切割的靶位點處同源重組，從而宿主細胞中的同源重組導致供體線性核酸在靶位點處整合。然后選擇其中供體DNA分子被整合到靶位點中的轉化宿主細胞。

在一些實施方式中，核酸酶是RNA引導的DNA內切核酸酶，并且該方法還包括將向導RNA引入細胞，所述向導RNA能夠將RNA引導的內切核酸酶引導至靶位點。向導RNA可以在含有衍生自馬克斯克魯維酵母的穩定元件的質粒上。RNA引導的DNA內切核酸酶可以是Cas9內切核酸酶。可以將編碼核酸酶的核酸預先整合到基因組中。

在一些實施方式中，將向導RNA引入細胞的步驟可以通過使宿主細胞與線性核酸接觸進行，所述線性核酸包含編碼該向導RNA的核酸序列或該向導RNA本身。在這些實施方式中，編碼向導RNA的核酸位于啟動子和終止子之間，并且向導RNA由宿主細胞中的線性核酸瞬時表達。線性核酸可以包含退火的tracrRNA和crRNA寡核苷酸。