[發(fā)明專利]用于遺傳工程改造克魯維酵母宿主細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880074362.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111356766A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Y·茨嘎也
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿邁瑞斯公司
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;陳揚(yáng)揚(yáng)

1.一種用于修飾克魯維酵母(Kluyveromyces)宿主細(xì)胞基因組中靶位點(diǎn)的方法，所述方法包括：

(a).使具有降低的非同源末端連接(NHEJ)活性的克魯維酵母接觸：

(i).能夠切割所述靶位點(diǎn)的核酸酶；和

(ii).包含編碼多肽的核酸序列的供體DNA分子，其中所述供體DNA分子能夠在切割的靶位點(diǎn)處同源重組，從而所述宿主細(xì)胞中的同源重組導(dǎo)致供體線性核酸在靶位點(diǎn)處整合；和

(b).選擇這樣的宿主細(xì)胞：其中所述供體DNA分子被整合到靶位點(diǎn)中，并且所述宿主細(xì)胞分泌由所述核酸序列編碼的多肽。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶是RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶，并且所述方法還包括將向?qū)NA引入細(xì)胞，所述向?qū)NA能夠?qū)⑺鯮NA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶引導(dǎo)至所述靶位點(diǎn)。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述向?qū)NA在含有衍生自馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)的穩(wěn)定元件的質(zhì)粒上。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶是Cas9內(nèi)切核酸酶。

5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，編碼核酸酶的核酸被預(yù)整合到所述基因組中。

6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將向?qū)NA引入細(xì)胞的步驟通過(guò)使所述宿主細(xì)胞接觸下述物質(zhì)進(jìn)行：

(i).線性核酸，其包含

(1).編碼所述向?qū)NA的核酸序列或

(2).所述向?qū)NA。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，編碼所述向?qū)NA的核酸位于啟動(dòng)子和終止子之間，并且所述向?qū)NA由所述宿主細(xì)胞中的線性核酸瞬時(shí)表達(dá)。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述線性核酸包含退火的tracrRNA和crRNA寡核苷酸。

9.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞接觸線性核酸，所述線性核酸能夠與其自身或與所述宿主細(xì)胞所接觸的一種或多種其他線性核酸同源重組，從而所述宿主細(xì)胞中的同源重組導(dǎo)致環(huán)狀染色體外核酸的形成，所述環(huán)狀染色體外核酸包含選擇性標(biāo)志物的編碼序列。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述環(huán)狀染色體外核酸還包含衍生自馬克斯克魯維酵母的穩(wěn)定元件。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述穩(wěn)定元件包含與SEQ ID NO：2至少95％相同的著絲粒序列(CEN)序列以及與SEQ ID NO：3至少90％相同的自主復(fù)制序列(ARS)共有序列。

12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，穩(wěn)定元件與長(zhǎng)度小于750bp且包含SEQ IDNO:1殘基202-876的序列至少90％相同。

13.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述穩(wěn)定元件與SEQ ID NO：1至少95％相同。

14.如權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述環(huán)狀染色體外核酸還包含能夠?qū)⑺龊怂崦敢龑?dǎo)至所述靶位點(diǎn)的向?qū)NA的編碼序列。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述環(huán)狀染色體外核酸還包含編碼crRNA活性和tracrRNA活性的序列。

16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述crRNA活性和tracrRNA活性表達(dá)為單個(gè)連續(xù)RNA分子。

17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶是兆核酸酶。