[發(fā)明專利]真核細(xì)胞系

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880069487.5
• 申請(qǐng)日: 2018-10-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111386126A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 斯特凡諾·科洛卡;阿爾弗雷多·尼科西亞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: NOUSCOM股份公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;C12N5/10;C07K14/005;C12N15/86
• 代理公司: 北京柏杉松知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王春偉;劉繼富

本發(fā)明涉及細(xì)胞系、所述細(xì)胞系的用途以及使用所述細(xì)胞系制備感染性病毒顆粒的方法。

本發(fā)明涉及細(xì)胞系、所述細(xì)胞系的用途以及使用所述細(xì)胞系制備感染性病毒顆粒的方法。

發(fā)明背景

需要新型疫苗來(lái)預(yù)防或治療諸如HIV、丙型肝炎、瘧疾、結(jié)核病和癌癥等疾病。臨床前和臨床證據(jù)支持T細(xì)胞免疫，尤其是CD8+T細(xì)胞在清除這些疾病中的作用。誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的一種方法是通過(guò)基因遞送在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該抗原和合適的病原體衍生的先天激活因子；基因疫苗或基于基因的疫苗采用生理抗原加工和I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)來(lái)激活CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。復(fù)制缺陷型腺病毒載體已通過(guò)用表達(dá)盒替換抗原的必需E1區(qū)而廣泛用于基因疫苗。腺病毒載體作為基因遞送系統(tǒng)是有吸引力的，因?yàn)樗鼈兗锤腥緩?fù)制細(xì)胞也感染非復(fù)制細(xì)胞，具有廣泛的組織趨向性，在可用的包裝細(xì)胞系中非常有效地繁殖，并且具有可擴(kuò)展且可負(fù)擔(dān)的生產(chǎn)過(guò)程。實(shí)際上，在動(dòng)物模型和人類臨床試驗(yàn)中，基于腺病毒的載體比基于痘病毒、慢病毒、α病毒和裸露的DNA的其他遺傳疫苗載體能誘導(dǎo)更有效的抗原特異性CD8+T細(xì)胞。然而，腺病毒載體作為基因疫苗載體的成功開(kāi)發(fā)最終將不僅取決于它們的免疫效力，而且取決于可擴(kuò)展和可再現(xiàn)的生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞底物的可用性。腺病毒載體能夠表達(dá)高水平的抗原蛋白，它們不僅在體內(nèi)靶組織中遞送，而且在補(bǔ)體細(xì)胞系(complementing cell line)的生產(chǎn)過(guò)程中遞送。在當(dāng)前的載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)是由強(qiáng)大的人巨細(xì)胞病毒即/早期啟動(dòng)子(HCMV啟動(dòng)子，human cytomegalovirus immediate/early promoter)驅(qū)動(dòng)的，在載體生產(chǎn)過(guò)程中該啟動(dòng)子不僅在靶組織中而且在包裝細(xì)胞系中均可以高水平表達(dá)。一些證據(jù)表明，包裝細(xì)胞系中的高轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以干擾腺病毒的復(fù)制。在我們對(duì)腺病毒載體拯救和繁殖的廣泛經(jīng)驗(yàn)中，已經(jīng)觀察到轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制的有害影響，從降低的載體產(chǎn)量到完全抑制復(fù)制。另外，通過(guò)選擇重排的載體種類，對(duì)載體復(fù)制的干擾可能導(dǎo)致載體本身的遺傳不穩(wěn)定性。

在生產(chǎn)過(guò)程中能夠抑制腺病毒載體攜帶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)可以防止轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)的負(fù)面影響。因此，該系統(tǒng)是基于表達(dá)高水平TetR的細(xì)胞系，并且是通過(guò)攜帶在人類巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子或其他強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下的轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體，其他強(qiáng)啟動(dòng)子如CASI啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、EF1α啟動(dòng)子，其具有兩個(gè)或多于兩個(gè)拷貝的插入啟動(dòng)子TATA框的下游的TetR結(jié)合位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

在第一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞系，其中四環(huán)素阻遏物(Tet-R)在細(xì)胞或部分細(xì)胞啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。

在第二方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的細(xì)胞系在制備感染性病毒顆粒中的用途。

在第三方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)感染性病毒顆粒的方法，其包括以下步驟：

(i)使本發(fā)明的第一方面的細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)，所述細(xì)胞還包含在不存在

四環(huán)素或四環(huán)素類似物的情況下能夠體外組裝成感染性病毒顆粒的病毒

基因組；或

(ii)用病毒載體，優(yōu)選腺病毒載體感染本發(fā)明第一方面的細(xì)胞系的細(xì)胞；

和

(iii)回收病毒顆粒。

附圖說(shuō)明

在下文中，描述了本說(shuō)明書(shū)中包括的附圖的內(nèi)容。在此上下文中，還請(qǐng)參考上面和/或下面的本發(fā)明的詳細(xì)描述。

圖1：pneo/CAG-TetR圖。Pneo/CAG-TetR包含四環(huán)素阻遏物和G418抗性基因的表達(dá)盒。

圖2：SeAP在克隆M9和M38中的表達(dá)。將克隆接種在培養(yǎng)瓶T25中，并在存在或不存在四環(huán)素的情況下以moi 30(感染復(fù)數(shù))使其感染ChAdETetOSeap。然后通過(guò)計(jì)算有和沒(méi)有四環(huán)素的情況下感染后48小時(shí)的比率，獲得每個(gè)單個(gè)克隆的得分。克隆M9顯示最佳比率+/-tet。