[發明專利]用于鑒定免疫細胞特別是PD1+細胞的作為表觀遺傳標志物的PDCD1

在審

• 申請號: 201880066521.3
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN111212920A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 斯文·歐萊克;烏多·巴倫
• 申請（專利權）人: 艾皮恩蒂斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/6881
• 分類號: C12Q1/6881
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及一種用于鑒定PD1+細胞的方法，特別是一種體外方法，包括分析哺乳動物的程序性細胞死亡1(PDCD1)基因區中至少一個CpG位置的甲基化狀態，其中，與非PD1+細胞相比，所述基因區的去甲基化或缺乏甲基化指示PD1+細胞。根據本發明的分析可以在表觀遺傳水平上鑒定PD1+細胞，并將其與復雜樣品中的所有其他細胞(例如其他血液細胞或免疫細胞)區分開來。本發明還提供了一種用于定量PD1+細胞(特別是在復雜樣品中)的改進方法。該方法可以在沒有純化和/或富集細胞的步驟的情況下，優選在全血和/或非胰蛋白酶化組織中進行。

本發明涉及一種用于鑒定PD1+細胞的方法，特別是一種體外方法，包括分析哺乳動物的程序性細胞死亡1(PDCD1)基因區中至少一個CpG位置的表觀遺傳修飾/特性(包括甲基化狀態)，其中與非PD1+細胞相比，所述基因區的去甲基化或缺乏甲基化指示PD1+細胞。根據本發明的分析可以在表觀遺傳水平上鑒定PD1+細胞，并將其與復雜樣品中的所有其他細胞(例如其他血液細胞或免疫細胞)區分開來。本發明還提供了一種用于定量PD1+細胞(特別是在復雜樣品中)的改進方法。該方法可以在沒有純化和/或富集細胞的步驟的情況下，優選在全血和/或非胰蛋白酶化組織中進行。

此外，本發明涉及用于進行上述方法的試劑盒及其相應的用途。本發明的一個目的是提供一種新的、更強健的方法來定量檢測和測量哺乳動物的任何實體器官或組織的血液、或體液中的PD1+細胞。

發明背景

通常，PD1+細胞被定義為主動合成由基因程序性細胞死亡1編碼的蛋白質的細胞。在目前的應用中，PD1+細胞被定義為通過提供可獲得的未修飾的原始DNA序列(如下文所述和定義的內含子區中的CpG基序沒有修飾所示)而使其能夠表達PD1的細胞。

PD1+細胞是表達程序性細胞死亡蛋白1(PDCD1，也被稱為PD-1)的細胞。PDCD1表達于多種免疫細胞類型，如活化的胸腺來源的淋巴細胞(T淋巴細胞，T細胞)、前體B細胞、髓系來源的樹突狀細胞和自然殺傷(NK)細胞。PDCD1在免疫發育和炎癥的多個不同階段中表達，并且PDCD1是參與免疫調節和自我耐受的重要檢查點受體。PDCD1的表達通過減少組織的滯留和細胞因子的產生，以及通過減少輔助細胞在早期免疫應答中的形成，減緩了初始急性抗原鑒定過程中的免疫應答。有趣的是，PDCD1能促進抗原特異性T細胞的凋亡(程序性細胞死亡)，同時抑制調節性T細胞(其是抗炎性T細胞)的凋亡。因此，PDCD1是有效獲得性免疫應答的重要調控因子。

盡管在個體中幾乎所有的細胞都含有完全相同的DNA密碼的互補物，但較高等的生物體必須強加和維持多種組織類型中不同的基因表達模式。大多數基因調控是暫時性的，取決于細胞的當前狀態和外部刺激的變化。另一方面，持續性調控是表觀遺傳學的主要作用——不會改變DNA的基本遺傳編碼的遺傳性調控模式。DNA甲基化是表觀遺傳調控的典型形式；它作為細胞的穩定記憶，在維持各種細胞類型的長期同一性方面發揮著至關重要的作用。最近，發現了其他形式的表觀遺傳調控。除了“第五堿基”5-甲基胞嘧啶(mC)外，還可以找到第六堿基(5-羥甲基胞嘧啶，hmC)、第七堿基(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八堿基(5-羧基胞嘧啶，cC)(Michael J.Booth等人，Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science，2012年5月18日,Vol.336no.6083pp.934-937)。

上述DNA修飾的主要目標是胞嘧啶鳥嘌呤(CpG位點)的雙核苷酸序列；在這種情況下，胞嘧啶(C)可以經歷簡單的化學修飾以形成甲酰化、甲基化、羥甲基化或羧化。在人類基因組中，CG序列比預期的要稀少得多，除了在某些稱為“CpG島”的相對密集的集簇中。CpG島通常與基因啟動子相關，據估計，一半以上的人類基因有CpG島(Antequera和Bind，ProcNatl Acad Sci USA 90：11995-9，1993)。