[發明專利]用于鑒定免疫細胞特別是嗜堿性粒細胞的作為表觀遺傳標志物的MCC

在審

• 申請號: 201880065699.6
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN111295452A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 斯文·歐萊克;烏多·巴倫
• 申請（專利權）人: 艾皮恩蒂斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/6881
• 分類號: C12Q1/6881
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及一種用于鑒定嗜堿性粒細胞的方法，特別是一種體外方法，包括分析哺乳動物的“結直腸癌突變”(MCC)基因的基因區中至少一個CpG位置的修飾例如甲基化狀態，其中，與非嗜堿性粒細胞或外周血或其他組織中的任何其他細胞類型相比，所述基因區的去甲基化或缺乏修飾或甲基化指示嗜堿性粒細胞。根據本發明的分析可以在表觀遺傳水平上鑒定嗜堿性粒細胞，并將其與復雜樣品中的所有其他細胞(例如其他血液細胞或免疫細胞)區分開來。本發明還提供了一種用于定量嗜堿性粒細胞(特別是在復雜樣品中)的改進方法。該方法可以在有或沒有純化和/或富集細胞的步驟的情況下，優選在全血和/或非胰蛋白酶化組織中進行。最后，本發明提供了基于亞硫酸氫鹽處理的核酸的引物、探針和擴增子。

本發明涉及一種用于鑒定嗜堿性粒細胞的方法，特別是一種體外方法，包括分析哺乳動物的“結直腸癌突變”(MCC)基因的基因區中至少一個CpG位置的修飾例如甲基化狀態，其中，與非嗜堿性粒細胞或外周血或其他組織中的任何其他細胞類型相比，所述基因區的去甲基化或缺乏修飾或甲基化指示嗜堿性粒細胞。根據本發明的分析可以在表觀遺傳水平上鑒定嗜堿性粒細胞，并將其與復雜樣品中的所有其他細胞(例如其他血液細胞或免疫細胞)區分開來。本發明還提供了一種用于定量嗜堿性粒細胞(特別是在復雜樣品中)的改進方法。該方法可以在有或沒有純化和/或富集細胞的步驟的情況下，優選在全血和/或非胰蛋白酶化組織中進行。

此外，本發明涉及用于進行上述方法的試劑盒及其相應的用途。本發明的一個目的是提供一種新的、更強健的方法來定量檢測和測量哺乳動物的任何實體器官或組織內的血液、或任何體液中的嗜堿性粒細胞。

發明背景

粒細胞約占所有白血細胞(也稱為白細胞)的60％。它們的主要功能是吞噬，即消化外來細胞如細菌、病毒和其他寄生蟲。粒細胞與其他白細胞，如單核細胞和淋巴細胞，可以通過充滿了有助于消化外來細胞的酶的細胞內顆粒的存在來區別。粒細胞也被稱為多形核白細胞(PMN、PML或PMNL)，因為它們的核形狀各異，通常裂成三段。粒細胞有三種形式，即中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。它們的名字來源于它們被不同染料染色的能力；例如中性粒細胞中的顆粒可以被中性染料染色，而嗜堿性粒細胞中的顆粒可以被堿性染料染色。

嗜堿性粒細胞是粒細胞中數量最少的，約占所有循環白細胞的0.01％～0.3％。他們參與炎癥反應的超敏反應，導致過敏癥狀。當受刺激時，嗜堿性粒細胞釋放組胺(這有助于引發炎癥)以及肝素(這防止血液凝固)。在嗜堿性粒細胞的細胞表面存在的蛋白質受體能夠結合IgE，從而促進對環境物質如花粉蛋白的選擇性應答。

盡管在個體中幾乎所有的細胞都含有完全相同的DNA密碼的互補物，但較高等的生物體必須強加和維持多種組織類型中不同的基因表達模式。大多數基因調控是暫時性的，取決于細胞的當前狀態和外部刺激的變化。另一方面，持續性調控是表觀遺傳學的主要作用——不會改變DNA的基本遺傳編碼的遺傳性調控模式。DNA甲基化是表觀遺傳調控的典型形式；它作為細胞的穩定記憶，在維持各種細胞類型的長期同一性方面發揮著至關重要的作用。最近，發現了其他形式的表觀遺傳調控。除了“第五堿基”5-甲基胞嘧啶(mC)外，還可以找到第六堿基(5-羥甲基胞嘧啶，hmC)、第七堿基(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八堿基(5-羧基胞嘧啶，cC)(Michael J.Booth等人，Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science，2012年5月18日，Vol.336 no.6083 pp.934-937)。

上述DNA修飾的主要目標是胞嘧啶鳥嘌呤(CpG位點)的雙核苷酸序列；在這種情況下，胞嘧啶(C)可以經歷簡單的化學修飾以形成甲酰化、甲基化、羥甲基化或羧化。在人類基因組中，CG序列比預期的要稀少得多，除了在某些稱為“CpG島”的相對密集的集簇中。CpG島通常與基因啟動子相關，據估計，一半以上的人類基因有CpG島(Antequera和Bind，ProcNatl Acad Sci USA 90：11995-9，1993)。