[發明專利]使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的雙鏈多聯體DNA的體內RNA或蛋白質表達

在審

• 申請號: 201880060299.6
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN111094574A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: B.M.戴維斯;J.R.尼爾松;高偉
• 申請（專利權）人: 通用電氣公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/67
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

1.一種用于體內RNA或蛋白質表達的方法，所述方法包括：

將雙鏈多聯體DNA引入真核細胞內，以生成所需RNA或蛋白質，

其中所述雙鏈多聯體DNA包含多個串聯重復序列，并且其中所述多個串聯重復序列各自包含表達序列，

其中所述雙鏈多聯體DNA包含一個或多個硫代磷酸酯化的核苷酸；和

其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率為至少1：1600。

2.權利要求1的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA是滾環擴增（RCA）產物DNA。

3.權利要求1或2的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率在1：1600至125：1600的范圍內。

4.權利要求1或2的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率在50：1600至125：1600的范圍內。

5.權利要求1或2的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率在75：1600至125：1600的范圍內。

6.權利要求1或2的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率為125：1600。

7.上述權利要求中的一項或多項的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA是未加工的或加工的RCA產物DNA。

8.上述權利要求中的一項或多項的方法，其中所述表達序列包含編碼序列、非編碼序列或其組合。

9.權利要求8的方法，其中所述編碼序列包含啟動子、開放讀碼框和任選地不依賴于帽的翻譯元件（CITE）。

10.權利要求9的方法，其中所述不依賴于帽的翻譯元件（CITE）包含內部核糖體進入位點（IRES）、翻譯增強元件（TEE）或其組合。

11.權利要求9或10的方法，其中所述開放讀碼框包含密碼子優化的序列用于增強翻譯。

12.權利要求9、10或11的方法，其中所述開放讀碼框包含用于所需蛋白質的純化的標簽序列、衍生自IRES的用于增強核糖體識別的氨基末端肽融合序列或其組合。

13.權利要求8-12中的一項或多項的方法，其中所述非編碼序列包含啟動子和轉錄終止序列。

14. 權利要求8-13中的一項或多項的方法，其中所述非編碼序列包括關于反義RNA、短干擾RNA（siRNA）、短發夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、微小RNA模擬物、轉移RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、CRISPR RNA或其組合的序列。

15.上述權利要求中的一項或多項的方法，其中所述表達序列是最簡單的表達序列，其缺乏在宿主細胞中繁殖質粒所需的任何無關序列。

16.上述權利要求中的一項或多項的方法，其中所述表達序列進一步包含聚A序列、轉錄終止序列、絕緣子序列或其組合。

17.上述權利要求中的一項或多項的方法，其中所述雙鏈多聯體DNA進一步包含含肌苷的核苷酸、鎖核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脫氧腺苷、2-硫代-脫氧胸苷、聚陽離子核苷酸或其組合。