[發明專利]使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的雙鏈多聯體DNA的體內RNA或蛋白質表達

在審

• 申請號: 201880060299.6
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN111094574A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: B.M.戴維斯;J.R.尼爾松;高偉
• 申請（專利權）人: 通用電氣公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/67
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

提供了用于體內RNA或蛋白質表達的方法。該方法包括將雙鏈多聯體DNA引入真核細胞內，以生成所需RNA或蛋白質。雙鏈多聯體DNA包括多個串聯重復序列，其中所述多個串聯重復序列各自包含表達序列。雙鏈多聯體DNA包含一個或多個硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率為至少1：1600。還提供了包含外源的雙鏈多聯體DNA的真核細胞，所述雙鏈多聯體DNA包含多個串聯重復序列。

發明領域

本公開內容總體上涉及RNA或蛋白質表達系統，其涉及雙鏈多聯體DNA的體內轉錄和/或翻譯。本公開內容特別涉及使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的雙鏈多聯體DNA的體內RNA或蛋白質表達。

發明背景

各種基于蛋白質和RNA的應用的增加已增加了對于RNA和蛋白質的大規模生產的需求。這些應用中的大多數，尤其是治療應用，需要蛋白質/RNA滿足在純度、效力、功效和安全性方面的嚴格質量標準。經常采用重組蛋白生產來滿足所需的大規模蛋白生產的期望。非常需要更高的生產效率和更低的成本，以使這些蛋白質/RNA產物在商業上可行。

傳統上，對于在哺乳動物細胞中的蛋白質的體內生產，使用質粒DNA的細胞轉染已用作主要工具。由相應的DNA序列產生期望的蛋白質或RNA涉及大量真核細胞的使用，并且一般以大體積規模例如100L執行。對于體內蛋白質生產，可以生成穩定的細胞系，并且擴增至足夠的數量，以生成所需的蛋白質產率。進一步地，在其中表達的蛋白質對宿主細胞是致死性的情況下，可以使用瞬時生產系統。使用無細胞的體外RNA或蛋白質表達系統，還可以在更短的時期內表達顯著更高數量的RNA或蛋白質。然而，體外轉錄-翻譯系統經常需要較大量的DNA模板。

一般地，質粒DNA在體內和體外轉錄-翻譯系統中用作模板DNA。然而，用于較大規模的瞬時/穩定轉染或無細胞表達的足夠質粒的制造經常是昂貴且麻煩的。例如，傳統的質粒生成方法需要勞動密集型的克隆和質粒純化。進一步地，大規模質粒制備的傳統方法存在被無關細菌組分和/或純化試劑污染的風險，其可能影響下游RNA表達和后續蛋白質生產。

合適的改造的DNA序列，尤其是僅含有啟動子和目的基因，并且缺乏對于在細菌中的維持必需的任何不期望的DNA序列（例如，復制起點或抗生素抗性基因）的DNA序列（其可以用于在真核細胞中的轉染，用于后續RNA和/或蛋白質生產）的快速、成本有效生產是高度期望的。等溫DNA擴增技術，例如滾環擴增（RCA），可以用于從環狀核酸模板開始生成如此大量的高質量DNA，伴隨較少的勞力、時間和費用。例如，RCA使得能夠快速產生合適的改造的DNA序列，例如僅含有啟動子和目的基因的DNA序列。

盡管使用真核細胞系和RCA產物DNA的少數RNA和蛋白質表達系統是目前可獲得的，然而，這些系統具有所需蛋白質的表達率相當低的缺點，導致重組蛋白質的低產率和高成本。存在關于適當的體內RNA和/或蛋白質表達系統的需要，所述表達系統提供在商業上可行的RNA和/或蛋白質的生產中的顯著改善。

發明概述

在一些實施方案中，提供了用于體內RNA或蛋白質表達的方法。該方法包括將雙鏈多聯體DNA引入真核細胞內，以生成所需RNA或蛋白質。雙鏈多聯體DNA包含多個串聯重復序列，其中所述多個串聯重復序列各自包含表達序列。雙鏈多聯體DNA包含一個或多個硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述雙鏈多聯體DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率為至少1：1600。

在一些實施方案中，提供了包含外源的雙鏈多聯體DNA的真核細胞，所述雙鏈多聯體DNA包含多個串聯重復序列。多個串聯重復序列各自包含硫代磷酸酯化的核苷酸，其中硫代磷酸酯化的核苷酸與總核苷酸的比率為至少1：1600。

附圖簡述

當參考附圖閱讀下述詳述時，本發明的這些及其它特點、方面和優點將變得更好理解。