[發明專利]樹突狀細胞的成熟

在審

• 申請號: 201880058877.2
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN111587288A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 基爾坦·溫卡·杰拉姆·德達;米歇爾·托馬西奇奧
• 申請（專利權）人: 生物克隆專利有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K35/15
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;康志梅

本發明涉及體外制備成熟樹突狀細胞的方法、樹突狀細胞成熟混合物、在體外制備抗原呈遞成熟樹突狀細胞的方法、制備含有成熟樹突狀細胞的疫苗的方法，根據所述方法制備的抗原呈遞成熟樹突狀細胞、含有抗原呈遞成熟樹突狀細胞的疫苗以及本發明的抗原呈遞成熟細胞的治療方法和應用。

背景技術

樹突狀細胞(DC)是有效的抗原呈遞細胞，可連接先天和后天免疫系統。作為B、T淋巴細胞和NK細胞的有效刺激物，它們對于免疫應答的發生、特異性和調節起至關重要的作用(Banchereau和Steinman(1998))。在外周組織中，發現它們處于未成熟的狀態，準備好攝取、處理和表達抗原。一旦遇到抗原并對其進行處理，樹突狀細胞就會急劇轉化為成熟細胞。在此過程中，抗原被呈遞給其他免疫功能細胞，誘導免疫反應。具體而言，成熟的樹突狀細胞向引流的次級淋巴器官遷移，在這里它們與T細胞、B細胞和NK細胞相互作用(Mellman和Steinman(2001))。本申請人表明了，可以利用樹突狀細胞的抗原呈遞能力，從而在體內靶向和根除癌癥和其他傳染性疾病的可能性。

本申請人開發了一種針對癌癥和傳染病的樹突狀細胞疫苗。在本發明中，一種利用樹突狀細胞成熟混合物在體外成熟樹突狀細胞(DC)的方法被用于癌癥和傳染病的免疫治療干預，其中，所述樹突狀細胞成熟混合物包含Toll樣受體(TLR)-3激動劑(安普利近)(Ampligen)、白介素(IL)-1β(IL-1β)、干擾素(IFN)-α、IFN-γ、CD40L和TLR-7/8激動劑(R848)。盡管使用樹突狀細胞作為抗癌疫苗并不是一種新療法，但是成熟劑在此之前還沒有被描述過。

本申請人還具有體外臨床前證據，表明上述樹突狀細胞疫苗可殺滅癌細胞。使用本發明的成熟混合物成熟的樹突狀細胞表現出最佳的成熟表型，該表型可以極化針對癌細胞的抗腫瘤T輔助反應。本申請人進一步提供了證據證明，這些成熟的細胞產生高水平的Th1效應細胞因子，IFN-γ和IL-12p70，這是樹突狀細胞疫苗在體內激活和誘導抗腫瘤Th1CD8+T細胞反應的能力的指標(Curtsinger et al.(1999),Schmidt and Mescher(1999),Xiao et al.(2009)).此外，IL-12p70已被證明在調節CD8+效應子功能，T細胞活化中必不可少，并且已被證明是乳腺癌患者更有利的臨床結果的關鍵指標(Curtsinger etal.(1999),Schmidt andMescher(1999),Xiao et al.(2009),Kristensen et al.(2012))。

本發明的主要優點是申請人開發了一種模范化的成熟方法和成熟混合物，可以容易地應用于其他類型的癌癥和傳染病。所述成熟混合物可以與研究者希望靶向的癌癥或傳染病抗原結合使用。目前的技術是安全的，可以直接轉移到其他疾病。

發明內容

在本發明的第一方面中，提供了一種體外產生成熟樹突狀細胞的方法，該方法包括(i)在Toll樣受體3(TLR-3)激動劑、IFN-α、IFN-γ、CD40L、IL-1β和Toll樣受體7/8(TLR-7/8)激動劑的存在下培養未成熟樹突狀細胞的步驟。

在本發明的一個實施方式中，所述TLR-3激動劑是(ritatolimod)，所述TLR-7/8激動劑是R848。所述TLR-3激動劑也可以是高分子量dsRNA聚合物，選自poly[I]:poly[CxU]；poly[I]:poly[GxU]；poly[A]:poly[UxC]；poly[A]:poly[UxG]；poly[U]:poly[AxC]；poly[U]:poly[IxU]；poly[C]:poly[GxA]；poly[C]:poly[GxU]；poly[G]:poly[CxA]和poly[G]:poly[CxU]，其中x是通常3到40之間的數，最好是6到20之間的數。更優選地，所述dsRNA聚合物可以選自poly[I]:poly[C12U]和poly[C]:poly[I12U]。

在本發明的第二實施方式中，從外周血單核細胞樣本培養未成熟樹突狀細胞。值得注意的是，該樣本是從人或動物身上分離出來的。