[發(fā)明專利]用于將核酸偶聯(lián)至官能化的載體的方法和組合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880058806.2
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN111094318A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: L·喬伯特
• 申請（專利權(quán)）人: 生命技術(shù)股份公司
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00;C12N15/10;C12Q1/6834
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 傅宇昌

本發(fā)明涉及用于將核酸偶聯(lián)至官能化的表面或載體的方法和組合物。尤其，本發(fā)明提供了一種用于將胺化的核酸偶聯(lián)至被羧酸基團(tuán)官能化的載體的改進(jìn)方法，其中在有機(jī)溶劑存在下進(jìn)行所述偶聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于執(zhí)行所述偶聯(lián)反應(yīng)的組合物和試劑盒以及加載核酸的載體用于多種應(yīng)用的用途。

序列表

本申請含有序列表，其已經(jīng)以ASCII格式電子地提交，且特此通過引用整體并入。創(chuàng)建于2018年8月22日的所述ASCII副本被命名為LT01290PCT_SL.txt且具有1,529的大小。

本發(fā)明涉及用于將核酸偶聯(lián)至官能化的表面或固體載體的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及用于將胺化的核酸偶聯(lián)至被羧酸基團(tuán)官能化的載體的方法和組合物，以及這樣的經(jīng)修飾的載體用于多種應(yīng)用的用途。

背景技術(shù)

可以為了多種應(yīng)用將核酸固定化在固體載體上，所述應(yīng)用包括在載體上的化學(xué)或酶促核酸合成、測序反應(yīng)、用于純化物質(zhì)的親和色譜法、或用在體外診斷中以鑒別和定量非常少量的靶標(biāo)的雜交測定。固定化的核酸經(jīng)常被用于從復(fù)雜混合物或生物樣品特異性地分離靶配體，其中將核酸設(shè)計(jì)成與期望的靶分子選擇性地雜交。

適合用于固定化核酸的不同類型的材料是本領(lǐng)域已知的，包括尼龍、硝化纖維素、活化的瓊脂糖、重氮化的纖維素、膠乳顆粒、塑料、聚苯乙烯、玻璃和聚合物包被的表面。這些材料以許多形式使用，諸如膜、平板、載玻片、芯片、樹脂、珠、探針、微量滴定板、浸漬棒等。多種化學(xué)修飾可用于核酸與這些載體(它們經(jīng)常被稱作(固體)載體)的共價(jià)偶聯(lián)(直接地或通過接頭)。為了允許核酸分子的結(jié)合，典型地將載體官能化以暴露親核基團(tuán)，其與核酸上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)。可替換地，將反應(yīng)性基團(tuán)引入載體以與存在于核酸中的親核體反應(yīng)。合適的基團(tuán)或部分包括羥基、巰基、氨基和活化的羧酸基團(tuán)，而能夠與這些反應(yīng)的基團(tuán)包括二氯三嗪基、烷基環(huán)氧基、馬來酰亞胺基、溴乙酰基和其它。用于將核酸偶聯(lián)至不同類型的官能化的固體載體的策略描述在例如Gosh和Musso(Nuc.Acid Res.,15(13),5353-5372,1987)或Devor等人(“Strategies for Attaching Oligonucleotides to SolidSupports”,Integrated DNA Technologies,2005)。取決于反應(yīng)性基團(tuán)或親核基團(tuán)在固體載體和核酸分子上的存在，可以直接執(zhí)行偶聯(lián)或用雙官能試劑或交聯(lián)劑執(zhí)行偶聯(lián)。雙官能試劑和偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的且可從商業(yè)來源諸如Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、ProteoChem等得到。

一種廣泛使用的用于將核酸附接至固體載體的表面化學(xué)類型是羧酸官能團(tuán)。具有羧酸官能團(tuán)的表面通常可以如下提供：用帶有這樣的羧酸基團(tuán)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物處理未包被的表面(例如未包被的聚合物顆粒)。例如，與甲基丙烯酸的溶液共聚得到帶有末端羧基的聚合物涂層。為了允許與羧酸包被的表面的共價(jià)偶聯(lián)，典型地用官能性反應(yīng)性基團(tuán)修飾核酸。例如，可以在它的5’或3’末端給核酸提供伯氨基以允許胺化的分子與活化的羧酸酯表面的偶聯(lián)(例如使用碳二亞胺化學(xué))，這產(chǎn)生共價(jià)的羰基酰胺鍵。可替換地，可以將核酸以巰基修飾形式提供并可以經(jīng)由烷基化劑共價(jià)地連接至馬來酰亞胺修飾的表面。

許多應(yīng)用需要非常有效的偶聯(lián)方法以允許核酸向給定的載體上的定量負(fù)載，這會促進(jìn)偶聯(lián)產(chǎn)率的可預(yù)測性并因而促進(jìn)偶聯(lián)反應(yīng)的可靠性。但是，當(dāng)在水性緩沖液中使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)坊暮怂崤悸?lián)至羧酸官能化的載體時(shí)(例如通過使用碳二亞胺化學(xué)以活化羧酸基團(tuán))，通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)的偶聯(lián)效率是有限的。經(jīng)常通過提供增加的量的核酸以得到固定化的核酸的足夠產(chǎn)率來補(bǔ)償?shù)团悸?lián)效率。標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序的另一個(gè)經(jīng)常觀察到的缺點(diǎn)是經(jīng)由核酸的內(nèi)部仲胺基團(tuán)的非特異性偶聯(lián)事件的高發(fā)率或固定化的寡核苷酸的不利雜交動力學(xué)，它們二者可能導(dǎo)致在不同測定中的高背景。

因而，普遍希望開發(fā)具有提高的偶聯(lián)效率的方法，其導(dǎo)致表面結(jié)合的核酸的高且可預(yù)測的產(chǎn)率，而不需要增加向偶聯(lián)反應(yīng)中加入的核酸分子的量。