[發(fā)明專利]利用疏水相互作用分離細(xì)胞外囊泡的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880058719.7
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN111065730A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李昌津;高用松;樸鉉澤
• 申請（專利權(quán)）人: 羅塞塔外排體株式會社
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;B01D15/36
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學(xué)辰

本發(fā)明涉及一種分離細(xì)胞外囊泡的方法，具體涉及一種利用細(xì)胞外囊泡的疏水性分離細(xì)胞外囊泡的方法，以及使用所述方法分離的細(xì)胞外囊泡。當(dāng)使用所述方法時，本發(fā)明所述分離細(xì)胞外囊泡的方法能夠從包括血液和尿液的各種動物體液或包括癌癥組織在內(nèi)的各種組織中分離出不含用常規(guī)方法難以消除的脂蛋白污染的細(xì)胞外囊泡。所述方法可以解決脂蛋白污染引起的常規(guī)問題，并且有望成為一項(xiàng)重要的技術(shù)，對使用從各種動物體液或組織中分離的細(xì)胞外囊泡的各種研究產(chǎn)生重大影響，如特征和功能研究、多組學(xué)研究、新型生物標(biāo)志物的挖掘、診斷和治療等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離細(xì)胞外囊泡的方法，具體涉及一種利用細(xì)胞外囊泡的疏水性分離細(xì)胞外囊泡的方法，并且涉及一種通過所述方法分離的不含包括脂蛋白在內(nèi)的雜質(zhì)的細(xì)胞外囊泡。

背景技術(shù)

細(xì)胞外囊泡是納米級的顆粒(20-100,000nm)，可從地球上的所有細(xì)胞中自然釋放，并具有源于細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。對于動物而言，細(xì)胞外囊泡被發(fā)現(xiàn)存在于體液(例如血液、唾液、淚液、鼻粘液、汗液、尿液、糞便、腦脊液(CSF)、腹水、羊水、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液、精液、乳汁等)以及各種腫瘤或正常組織中。

細(xì)胞外囊泡含有來自分泌細(xì)胞(母細(xì)胞)的各種生理活性物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、RNA等)，故其可以體現(xiàn)母細(xì)胞的生理和病理特征。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡可作為載體與其他細(xì)胞和組織結(jié)合，以將生理活性物質(zhì)從母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞和組織，從而執(zhí)行各種生理和病理功能。因此，細(xì)胞外囊泡的成分和功能正在不斷被研究，以期利用細(xì)胞外囊泡作為診斷和治療各種疾病的新方法。

一般而言，已經(jīng)有許多技術(shù)被用于分離細(xì)胞外囊泡，包括超速離心、密度梯度離心、超聲裂解、分子篩、聚合物沉淀、鹽沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層析、親和層析和雙液相體系。其中，超速離心是應(yīng)用最廣泛的。該技術(shù)可有效地從相對較小的材料中分離出納米顆粒，因此可用于從各種材料(包括樣品中的可溶性蛋白質(zhì))中分離細(xì)胞外囊泡。

關(guān)于細(xì)胞外囊泡的利用，業(yè)界正在進(jìn)行研究：分析從體外培養(yǎng)的細(xì)胞分離的細(xì)胞外囊泡的成分以挖掘新的生物標(biāo)志物，以及對包括血液或各種組織(包括癌癥組織)的動物體液中分離的細(xì)胞外囊泡的成分(例如蛋白質(zhì)、核酸等)進(jìn)行定量比較，從而在包括診斷、預(yù)后評估或疾病治療在內(nèi)的許多方面利用細(xì)胞外囊泡。

特別地，對利用源自包括血液(血清和血漿)和尿液的各種動物體液以及癌組織在內(nèi)的各種組織的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行診斷和治療的需求很大。然而，因?yàn)榇嬖谟趧游矬w液或組織中的納米顆粒包括各種形式的脂蛋白以及細(xì)胞外囊泡，所以難以通過常規(guī)的細(xì)胞外囊泡分離技術(shù)選擇性地單獨(dú)分離細(xì)胞外囊泡。

脂蛋白是運(yùn)輸膽固醇和甘油三酸酯的重要因子，膽固醇和甘油三酸酯是細(xì)胞構(gòu)造必不可少的膜的基礎(chǔ)。另外，已知脂蛋白可以用作在血液中運(yùn)輸細(xì)胞外核酸的載體(NatCell Biol,2011,Vicker et al.,ISSN:1476-4679)，這點(diǎn)非常類似于在血液內(nèi)運(yùn)輸細(xì)胞外核酸的細(xì)胞外囊泡。根據(jù)大小(nm)和密度(g/mL)，脂蛋白分為以下納米顆粒：高密度脂蛋白(HDL；5-15nm，1.063g/mL)，低密度脂蛋白(LDL；18-28)nm，1.019-1.063g/mL)，中密度脂蛋白(IDL；25-50nm，1.006-1.019g/mL)，極低密度脂蛋白(VLDL；30-80nm，0.950-1.006g/mL)和乳糜微粒(100-1000nm，約0.95g/mL)。

血液中的這種細(xì)胞外囊泡和脂蛋白除了轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外核酸的功能外，在大小和密度等各個方面都彼此相似，因此難以選擇性地分離兩者(Biochem Biophys Res Commun,2009,Looze et al.,ISSN:1090-2104；J Extracell Vesicles,2014,Yuana et al.,ISSN:2001-3078；Sci Rep,2016,Sodar et al.,ISSN:2045-2322)。