[發明專利]拉曼成像技術測定抗生素敏感性的方法

在審

• 申請號: 201880058493.0
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN111133295A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 程繼新;穆罕默德·塞勒姆;洪偉力
• 申請（專利權）人: 普渡研究基金會
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N33/58;C12N5/02
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 李大為

本發明公開了一種通過受激拉曼散射顯微鏡測定抗生素敏感性的方法。該方法通過成像設備采集細菌樣本的激光信號并對細菌樣本的新陳代謝活動進行成像。為了確定細菌對某些抗生素的敏感性，可以用抗生素對樣本處理后進行成像。

技術領域

本發明涉及一種活細菌代謝活性的檢測方法，具體涉及一種通過超光譜受激拉曼散射顯微鏡檢測抗生素敏感性的方法。

背景技術

廣泛使用和濫用抗生素來對抗各種細菌感染已經引起耐藥菌數量的增加。因此，對于特定的傳染病而言，通過抗生素敏感性檢測(AST)分析特定細菌的抗生素反應顯得尤為重要。根據細菌種類的不同，常規的AST通常利用瓊脂平板和肉湯稀釋法進行細菌培養，一般最少需要16-24小時。正在開發的新技術雖然能進行快速檢測，但僅適用于特定細菌或需要耗時的樣品富集，具有一定的限制性。

拉曼光譜法，是一種用于測量分子振動的非標定量技術，已經應用于細菌AST的快速檢測。拉曼峰在指紋領域或重水D₂O代謝吸收中已經作為一種生物標記，以表征細菌對對抗生素治療的反應。然而，由于橫截面積較小，拉曼光譜產生的信號較弱，因此需要大量的樣本或者每個細胞需要較長的整合時間。利用金屬膠體或粗糙金屬表面，拉曼信號可以通過表面增強拉曼光譜(SERS)進行增強，隨著抗生素治療的改變，SERS已經被應用于以拉曼峰為依據的AST快速檢測，但SERS需要底物且信號變化較大，無法實際應用。

相干拉曼散射顯微鏡包括相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)顯微鏡，與自發拉曼散射相比，信號得到顯著改善。與CARS不同，SRS顯微鏡不具有非共振背景，已應用于細胞，組織和模型生物的代謝成像方面。但SRS并非完全沒有背景。超光譜受激拉曼散射(SRS)可以在每一個像素處記錄光譜，用以區別來自于背景的SRS信號，包括由于非線性吸收和交叉相位調制。

對單一細菌的代謝活動成像技術仍然具有很高的挑戰性。細菌的大小(直徑約為1μm)比哺乳動物細胞(約10μm)小的多，接近CARS或SRS顯微鏡的空間分辨率。此外，C-D拉曼信號比C-H信號弱很多，因此需要一種改進的AST方法。優選地，這種方法不需要延長樣品富集時間，并且在單各細胞水平上適用于各種細菌。

發明內容

一方面，本發明涉及一種適用于所有細菌的快速的抗生素敏感性檢測(AST)方法。

另一方面，本發明涉及一種利用超光譜受激拉曼散射(SRS)成像技術在單一細胞水平上監測細菌中葡萄糖-d7代謝活性的方法。

另一方面，本發明涉及一種適用于所有細菌的快速的(AST)方法，利用超光譜受激拉曼散射(SRS)成像技術在單個細胞水平上監測活細菌中葡萄糖-d7代謝活性。這種方法可以使用類似地其他的營養源，例如D₂O。萬古霉素敏感性(VSE)和耐藥性(VRE)腸球菌可以作為模型，利用SRS成像在單個細胞水平上可以檢測到細菌以及定量監測到它們的代謝活性，也可以檢測到對抗生素治療的代謝反應，從而在30分鐘內確定細菌敏感性和最低抑菌濃度(MIC)。同樣，成像方法還可以應用到具有不同抑菌或殺菌機制的其他抗生素上。由于葡萄糖是細菌生產的常見碳源，因此我們可以合理預測這種方法可以適用于多種細菌。

另一方面，本發明涉及一種樣品制備方法，適用于改良的細菌培養以及使信噪比最大化的成像設置，以獲得更加一致的圖像處理過程。