[發明專利]用于評估無細胞DNA中的DNA甲基化的方法和系統

在審

• 申請號: 201880056483.3
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN111032868A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 周向紅;何珊珊;瑪麗·路易莎·薩默;周永剛;倪曉暉;曾衛華
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12Q1/6883;C12Q1/6886;C40B20/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;尹玉峰

本公開內容涉及與富集特定DNA以用于甲基化狀態和/或譜分析(例如在癌癥診斷方法中)的方法有關的一些實施方案。在特定的一些實施方案中，所述方法利用無細胞DNA而不是基因組DNA作為DNA來源，并允許集中于富集具有兩個或更多個酶消化位點并包含至少一個CpG位點的片段。

相關申請的交叉引用

本申請要求2017年6月30日提交的美國臨時專利申請序列號62/527,236和2018年6月29日提交的美國臨時專利申請序列號62/691,815的優先權，其全部內容通過引用并入本文。

技術領域

本公開內容的領域的一些實施方案包括至少細胞生物學、分子生物學、DNA分析、文庫制備、診斷和/或醫學。

背景技術

癌細胞通常表現出異常的DNA甲基化模式。高甲基化和/或低甲基化的腫瘤DNA片段可通過細胞凋亡或壞死釋放到血流中，在那里它們可能成為體液(例如血漿或尿)中循環無細胞DNA(cfDNA)的一部分。因此，cfDNA甲基化譜分析是用于癌癥篩查的有前途的策略。全基因組亞硫酸氫鹽測序提供了DNA甲基化組的全面視圖，但是對整個基因組進行深度測序可能是昂貴的。簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced Representation BisulfiteSequencing，RRBS)是用于具有高CpG含量的基因組區域(大多數DNA甲基化發生在CpG位點)的甲基化譜分析的具有成本效益的技術。在RRBS中，首先用限制性內切核酸酶(通常是MspI)消化基因組DNA，然后進行大小選擇以富集CpG密集區域。這些區域僅構成基因組的約3％，但提供了關于基因組的全面DNA甲基化信息。但是，cfDNA在性質上已經片段化，表現出在166bp附近特征峰。如果遵循典型RRBS程序選擇40-220bp之間的片段，其可能非常類似于選擇整個cfDNA群體。因此，盡管從基因組DNA產生并存在于典型RRBS文庫中的幾乎每個片段都已被MspI剪切了兩次，但對于cfDNA而言并非如此。因此，對cfDNA進行典型的RRBS將缺少cfDNA的CpG富集，否則將有利于進行甲基化譜分析，例如用于臨床診斷應用。

本公開內容涉及將RRBS應用于cfDNA的本領域的改進，包括促進從血源性或血漿源性或尿源性(或其組合)cfDNA制備文庫用于甲基化譜分析。

發明內容

癌細胞通常可表現出異常的DNA甲基化模式，例如腫瘤抑制基因啟動子區域的高甲基化以及基因間區域的普遍低甲基化。因此，患者的DNA甲基化譜可以成為臨床實踐中癌癥評估的靶標。高甲基化和/或低甲基化的腫瘤DNA片段可通過例如細胞凋亡或壞死等過程釋放到血流中，在那里這些循環腫瘤DNA(ctDNA)成為血漿中循環無細胞DNA(cfDNA)的一部分。cfDNA甲基化譜分析的非侵入性可能是用于一種或更多種疾病或病癥篩查(包括至少常規癌癥篩查)的有效策略。本公開內容的一些實施方案提供了用于富集cfDNA的對于甲基化譜分析為信息性的區域(例如CpG島)的方法，從而與沒有這種富集措施的情況相比，用于甲基化譜分析所分析的核酸更有效。在特定方面，個體患有癌癥或懷疑患有癌癥或有患癌癥的風險，并且ctDNA分子的分析有助于確定個體是否患有癌癥或懷疑患有癌癥或有患癌癥的風險。cfDNA可以是雙鏈的、單鏈的或其混合物。

本公開內容的一些實施方案涉及與用于分析分子中甲基化量和/或位置的分子的制備有關的方法、系統和組合物。在特定的實施方案中，分子包含cfDNA，并且在特定方面，cfDNA來自個體(例如來自個體的血液或血漿或尿(或其組合)樣品)。在特定的實施方案中，本公開內容提供了用于評估cfDNA分子中，例如cfDNA分子的富CpG區域中的DNA甲基化的方法和系統。這樣的方法和系統可以富集無細胞DNA分子的富CpG區域，并且在方法的特定實施方案中有利地允許甲基化譜分析，例如用于臨床診斷應用。本公開內容提供了用于富集無細胞DNA分子的富CpG區域的改進的方法、系統和組合物，包括促進從cfDNA制備文庫用于甲基化譜分析。cfDNA的來源可以是例如血源性或血漿源性或尿源性(或其組合)。