[發(fā)明專利]用于評估無細(xì)胞DNA中的DNA甲基化的方法和系統(tǒng)在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201880056483.3 | 申請日： | 2018-06-29 |
| 公開（公告）號： | CN111032868A | 公開（公告）日： | 2020-04-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 周向紅;何珊珊;瑪麗·路易莎·薩默;周永剛;倪曉暉;曾衛(wèi)華 | 申請（專利權(quán)）人： | 加利福尼亞大學(xué)董事會 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12Q1/6883;C12Q1/6886;C40B20/04 |
| 代理公司： | 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227 | 代理人： | 鄭斌;尹玉峰 |
| 地址： | 美國加利*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 評估 細(xì)胞 dna 中的 甲基化 方法 系統(tǒng) | ||
1.用于處理或分析對象的多個無細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)分子的方法，其包括：
(a)使所述多個無細(xì)胞DNA(cfDNA)分子經(jīng)受足以使所述無細(xì)胞DNA分子的至少子集發(fā)生片段化而產(chǎn)生包含一個或更多個CpG位點(diǎn)的片段的條件，以提供多個DNA片段，所述多個無細(xì)胞DNA(cfDNA)分子的末端(i)不能與銜接子偶聯(lián)或(ii)被配置為用于從所述多個cfDNA的其余部分中分離；
(b)將所述銜接子與所述多個DNA片段的末端偶聯(lián)以提供多個經(jīng)標(biāo)記的DNA片段，所述經(jīng)標(biāo)記的DNA片段具有可與非甲基化的核酸堿基區(qū)分的甲基化的核酸堿基；
(c)對所述多個經(jīng)標(biāo)記的DNA片段或其衍生物進(jìn)行核酸測序以產(chǎn)生多個序列讀段；以及
(d)處理所述多個序列讀段以(i)從所述多個序列讀段兩端的所述銜接子鑒定序列，以及(ii)在鑒定所述序列的情況下，則將來自所述多個無細(xì)胞DNA分子的無細(xì)胞DNA分子鑒定為具有一個或更多個CpG位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個DNA片段的至少子集具有甲基化的核酸堿基。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中將無細(xì)胞DNA分子鑒定為具有一個或更多個CpG位點(diǎn)包括將無細(xì)胞DNA分子鑒定為具有兩個或更多個CpG位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在(b)之前或之后，從所述多個DNA片段中分離具有所述末端的所述cfDNA分子的片段。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述片段與磁珠偶聯(lián)，并且其中使用磁分離來分離所述片段。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在(b)之前或之后，使所述多個cfDNA分子、所述多個DNA片段或其衍生物經(jīng)受足以使所述甲基化的核酸堿基與所述非甲基化的核酸堿基區(qū)分開的條件。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中使所述多個cfDNA分子、所述多個DNA片段或其衍生物經(jīng)受所述條件包括對所述多個DNA片段進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述多個經(jīng)標(biāo)記的DNA片段或其衍生物經(jīng)受足以使所述甲基化的堿基與所述非甲基化的核酸堿基區(qū)分開的條件。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中使所述多個經(jīng)標(biāo)記的DNA片段或其衍生物經(jīng)受所述條件包括對所述多個經(jīng)標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中(a)中的所述條件足以使所述經(jīng)修飾的cfDNA分子的所述至少所述子集片段化，以產(chǎn)生含有多個CpG位點(diǎn)的片段。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中(a)還包括對所述多個cfDNA分子進(jìn)行限制酶消化，以使所述多個cfDNA分子的所述至少所述子集片段化，以產(chǎn)生含有所述一個或更多個CpG位點(diǎn)的片段。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中使用一種或更多種限制酶進(jìn)行所述限制酶消化，其富集來自所述多個cfDNA分子的具有CpG位點(diǎn)的DNA片段。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或更多種限制酶包含MspI、HpaII和/或TaqI。
14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中每個所述銜接子包含被配置為與核酸測序儀的流動池偶聯(lián)的功能序列。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中在(b)中偶聯(lián)所述銜接子包括將所述銜接子與所述多個DNA片段的所述末端連接。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其還包括在所述連接之前，對所述多個DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)或核酸堿基加尾。
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