[發明專利]用于制備可移植性軟骨組織的方法

有效

• 申請號: 201880048374.7
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN110944684B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: G·羅爾;C·卡普斯;C·埃申
• 申請（專利權）人: 科.東股份公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61L27/38;G01N33/68
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 傅宇昌

本發明涉及用于通過從軟骨細胞或球狀體中進行選擇和挑選來制備軟骨組織的方法，以及所述軟骨組織作為藥用組合物、藥物、移植物的用途。特別地，本發明涉及用于鑒定合適的軟骨細胞以便制備軟骨組織(其特別地為了移植目的)的標志物。

說明書

本發明涉及用于通過從軟骨細胞或球狀體中進行選擇和挑選來制備軟骨組織的方法，以及所述軟骨組織作為藥用組合物、藥物或移植物的用途。特別地，本發明涉及用于鑒定合適的軟骨細胞以便制備軟骨組織(其特別地為了移植目的)的標志物。

雖然關節軟骨顯示出值得注意的抵抗能力，但是該組織不具有或具有非常低的進行自我修復和再生的能力，而且未治療的損害可以導致例如骨關節炎。這種低的進行自發再生的潛力導致細胞療法(例如，自體軟骨細胞移植(ACT))的發展，以力求提供功能性的和無痛的關節軟骨缺陷的修復。存在高的對于用于軟骨再生的方法的需求，例如在具有創傷性損害或甚至具有軟骨退化癥狀的年輕的有活力的患者中，或者為了治療軟骨缺陷。

用人軟骨細胞的生物化學和分子研究受到一系列因素的阻礙，例如與非常少數目的在活組織檢查中可用的細胞相聯系的人組織的可得性不足，經培養的軟骨細胞的有限的增殖能力和高的表型不穩定性。

軟骨細胞是一種來源于成軟骨細胞并定居在軟骨組織中的細胞。與細胞間質(細胞外基質(ECM))一起，軟骨細胞構成軟骨，特別是關節軟骨的主要組成部分。

已經知道，通過模擬胚胎發育的某些過程，例如在瓊脂糖基底上三維地培養人軟骨細胞，從而產生在其分化狀態方面優于單層細胞并且具有例如軟骨樣特性的細胞聚集體。盡可能準確地反映了天然骨關節組織的這些特性以膠原II(透明軟骨的細胞外基質的主要結構蛋白質)、蛋白聚糖(例如，聚集蛋白聚糖)和細胞內的軟骨細胞特異性的蛋白S100的表達為特征。

此外，希望的是，在以單層培養物的細胞擴增期期間必然被上調的膠原I的表達在細胞聚集體中重又降低，這是因為這種蛋白質在天然關節軟骨中不存在。自2002年以來，如此產生的細胞聚集體(球狀體)已被申請人用于在年輕患者中處理和治療由損傷引起的軟骨缺陷。為此，從患者中取出本身的關節軟骨組織，更確切地說，從健康的軟骨區域中取出透明軟骨的活組織檢查物。通過用膠原酶溶液酶促消化軟骨組織而分離出位于軟骨組織中的軟骨細胞并使其通過標準細胞培養條件在細胞培養瓶中(單層培養物)在自體血清存在下進行擴增，并且提供足夠的軟骨細胞以供制備可移植性軟骨組織使用。經擴增的細胞形成細胞聚集體(所謂的球狀體)，其可以被移植。然而，如此制備出的細胞聚集體在其分化狀態方面受到限制，并且大多數顯示出重要的膠原II的相對弱的局部表達和蛋白聚糖的處于邊緣的合成，而不希望的膠原I則有相對強的表達。為了進一步改善這些細胞聚集體的分化，可以用某些生物活性物質使培養基豐富。這首要地包括多次在文獻中被描述為關于膠原合成的輔因子的生長因子TGF-β1-3以及L-抗壞血酸(維生素C)。但是，一方面，這種生物化學刺激常常不足以誘導在3D細胞聚集體中的軟骨細胞分化至產生軟骨典型的構造的程度，和另一方面，生長因子例如TGF-β的使用特別地對于在人中的臨床應用來說是值得懷疑的。

在DE 100 13 223中已經描述了以三維細胞聚集體的形式(例如以球狀體的形式)的人細胞的培養，以用于在人中的臨床應用，例如作為自體軟骨移植物，并且涉及用于在體外從骨干細胞、軟骨干細胞或間充質干細胞制備三維軟骨組織和骨組織的方法。在該情況下，將細胞首先以單層培養物進行培養，隨后以懸浮液培養如此長的時間，直至產生細胞聚集體，其包含至少40體積％的細胞外基質，在其中包埋有經分化的細胞。

在所述方法中，通過將細胞在涂覆有瓊脂糖的細胞培養容器中培養至少1-2周來制備細胞聚集體。

US 7,887,843 B2公開了一種用于在體外產生三維軟骨組織和骨組織的方法，其中通過將1×10⁵個細胞培養至少兩周來從骨干細胞、軟骨干細胞或間充質干細胞制備可移植性球狀體。