[發明專利]具有改進的精度和特異性的堿基編輯器

在審

• 申請號: 201880048366.2
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN110959040A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: J·K·喬昂格;J·M·格爾克
• 申請（專利權）人: 通用醫療公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N9/22;C12N9/78;C07K14/00
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

用于改進靶向性堿基編輯技術的全基因組特異性的方法和組合物。

優先權聲明

本申請要求2017年5月25日提交的美國臨時專利申請系列號62/511,296；2017年8月4日提交的美國臨時專利申請系列號62/541,544；和2018年1月26日提交的美國臨時專利申請系列號62/622,676的權益。前述文獻的完整內容通過引用的方式并入。

聯邦贊助研究或開發

本發明借助美國政府支持在國立衛生研究院授予的授權號GM118158下做出。美國政府在本發明中享有某些權利。

技術領域

本文中描述用于改進靶向性堿基編輯技術的全基因組特異性的方法和組合物。

背景技術

堿基編輯(BE)技術使用一種工程化的DNA結合結構域(如RNA指導的、無催化活性Cas9(死Cas9或dCas9)、切口酶形式的Cas9(nCas9)、或鋅指(ZF)陣列)以將胞苷脫氨酶結構域招募至基因組特定位置，以實現位點特異性胞嘧啶→胸腺嘧啶轉換置換^1,2。BE是用于治療細胞背景下表現出的遺傳疾病的特別有吸引力工具，其中通過同源介導修復(HDR)產生精確突變將是治療有益的，但是難以由基于核酸酶的傳統基因組編輯技術產生。由于HDR途徑限于細胞周期的G2和S期，例如，在主要由緩慢分裂或有絲分裂后的細胞群組成的組織中難以或不可能實現HDR結果³。此外，通過非同源末端接合介導對核酸酶誘導斷口(break)的修復所致競爭性和更有效誘導可變長度插入/缺失突變，可導致HDR修復的效率在編輯前后大幅度降低。相反，BE技術具有允許實施者在無需細胞類型可變的DNA修復機制情況下產生高度可控、高度精確突變的潛力。

發明內容

CRISPR堿基編輯器平臺(BE)擁有在無需供體DNA分子情況下產生精確的、用戶限定的基因組編輯事件的獨特能力。堿基編輯器(BE)按照位點特異性方式有效誘導胞苷至胸苷(C至T)堿基轉換，如通過CRISPR指導RNA(gRNA)間隔子序列確定的，其中所述堿基編輯器包含與胞苷脫氨酶結構域和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)(例如，BE3)融合的產生單鏈切口的CRISPR-Cas9(nCas9)蛋白¹。與全部基因組編輯試劑一樣，至關重要的是，在用于治療藥之前，首先確定然后降低BE產生脫靶突變的能力，從而限制其產生有害和不可逆基因編碼副作用的潛力。這里，我們提出對BE技術的技術改進，所述改進將使其能夠向臨床意義成熟。首先，我們描述了通過建立利用天然或工程化脫氨酶的BE，限制可用于BE脫氨的可用胞嘧啶底物的絕對數目的方法，所述脫氨酶僅可以使特定2-或3-核苷酸基因組背景下存在的胞嘧啶脫氨(表1)。

這些蛋白質可以包含表7中列出的一個或多個突變，例如，單獨或以任何可能組合用于增加脫氨酶蛋白或結構域的特異性。這些蛋白質可以包含表8中列出的一個或多個突變，例如，旨在改變可靶向的基序序列的突變，任選地與表7中的任何突變組合，例如，以產生底物序列改變和增加的工程化脫氨酶蛋白或結構域。另外，這些蛋白質可以包含表9中列出的一個或多個突變，任選地與表7或表8中列出的任何突變組合以產生工程化脫氨酶蛋白，例如，具有對三核苷酸基序中的第一或第三核苷酸改變的特異性并且具有相對于其他可能的脫氨底物基序，對其靶基序為增加的特異性。

在一些實施方案中，hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、或hAPOBEC3H的工程化變體包含表7、表8和/或表9中顯示的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述突變是N57A/G/Q/D/E；A71V；I96T；Y130F；或K60A/D/E或其組合。