[發明專利]用于分離和富集生物流體來源的細胞外囊泡的方法及其使用方法

在審

• 申請號: 201880046403.6
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN111133106A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: M.舍爾;E.埃坦;C.科蒂基亞;J.斯科格;R.基欽;S.余
• 申請（專利權）人: 外來體診斷公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;G01N33/48;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 翟建偉;彭昶

本發明總體涉及用于分離EV的亞群以鑒定生物標志物的方法，所述生物標志物可用于鑒定疾病(包括神經系統疾病)，確定疾病(包括神經系統疾病)的進展和/或預后疾病(包括神經系統疾病)。更具體地，本發明涉及各種外排體生物標志物(包括蛋白、蛋白修飾、糖、RNA、DNA、脂質和代謝物及其組合)的檢測技術。

相關申請的交叉引用

本申請要求2017年7月12日提交的美國臨時申請號62/531,845和2018年5月31日提交的美國臨時申請號62/678,853的優先權和權益，所述申請以其整體通過引用并入本文。

背景

細胞外囊泡(EV)，例如外排體和其他微囊泡，是由細胞釋放至細胞外環境中的小的脂質雙層包封的微粒。細胞外囊泡的直徑大小范圍通常為30 nm至10微米。EV從大多數(如果不是全部)細胞類型分泌，并且存在于體液(包括血漿、血清、尿液和腦脊液)中。EV充當天然載體，用于在細胞之間遞送大分子，包括蛋白、核酸(諸如DNA和RNA)、生物活性脂質和碳水化合物。已顯示EV信號傳導在各種各樣的生理和病理病況(包括致癌性疾病、神經退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和代謝病癥)中發揮重要作用。EV表面含有從起源的細胞的表面繼承的標志物(蛋白/碳水化合物)，允許對細胞和組織特異性EV進行分類和靶向。EV貨物(包括但不限于蛋白和RNA)取決于其起源細胞，供體病理生理狀態，細胞狀況、諸如氧化應激或代謝應激以及供體對治療干預的應答，且因此可以充當特定身體或疾病狀況的生物標志物的來源。血液在全身循環，并且在臨床實踐中定期收集，使其成為疾病生物標志物的理想來源。血清和血漿，血液的液體和無細胞相，含有EV以及其他顆粒，循環的游離蛋白，循環的游離DNA和脂質。血漿樣品中的某些組分(諸如白蛋白和補體系統)的豐度使得檢測稀有代謝物和蛋白特別有挑戰性。蛋白檢測主要基于抗體-抗原相互作用，通常被稱為免疫測定。傳統的方法、如凝膠電泳(western印跡)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)和免疫化學發光以及較新的數字方法、如單分子陣列(Simoa)和Erenna使用該原理。免疫測定性能取決于抗體的質量(靈敏度和特異性)，與檢測方法無關。抗體-抗原相互作用特性取決于抗體特異性和相互作用的環境，其包括：鹽和蛋白的緩沖液濃度、pH和抗原的可用性。血漿和血清富含不同組分、諸如蛋白和代謝物，并且具有豐富蛋白的該復雜環境對于蛋白免疫測定而言是不良的環境，尤其是如果靶標分析物豐度較低。使用EV克服該問題，因為EV或EV的亞群的純化將減少樣品的復雜性，并且允許從樣品檢測低豐度的靶標或表位。此外，生物流體(諸如血漿或血清)中的RNA本質上是不穩定的，并且經受將其消化的各種類型的RNA酶。

目前，通過有或沒有密度梯度的超速離心分離EV。盡管該過程產生相對純的EV群體，但其費力，效率低下，并且生成高樣品間差異。其他方法包括化學沉淀，其共同分離檢測測定中可以干擾的非囊泡組分。因此，對于免疫測定方法以及其他檢測方法，具有低EV純度的分離方法不是最優的。此外，這些方法富集血漿中發現的許多種類的EV，代表從多種細胞類型分泌的EV的高度異質的群體。來自不同細胞起源的EV類型的大型混合物可以干擾免疫測定，或過度代表來自正常組織和細胞的蛋白和RNA特征，其掩蔽來自疾病EV的概況。由于這些原因，用于分離總EV群體或純化EV的特定亞群的簡單且可重現的方法可以顯著增強基于EV相關的蛋白和RNA的生物標志物的檢測。

神經退行性疾病經數十年發展，并且必須在發生不可逆的神經元損傷之前開始有效的預防性療法。不幸的是，神經退行性疾病經常直至到達晚期才被認識到，因為診斷基于臨床癥狀，所述臨床癥狀直至嚴重的神經系統損害已經發生才顯現。診斷的驗證需要昂貴的生物成像程序和/或對腦脊液的侵入性研究。即便如此，只有通過腦組織的死后神經解剖學和神經化學分析，才可能進行明確的診斷。許多值得注意的藥物試驗失敗中顯現無法在晚期醫學干預神經退行性疾病，導致尚未對主要的神經退行性疾病(諸如阿爾茨海默氏病)進行任何改變疾病的治療。基于EV的生物標志物可能填補該空白，以使得能夠早期檢測，和非侵入性連續監測，甚至在疾病癥狀發生之前。