[發明專利]使用核小體相互作用蛋白結構域來增強靶向基因組修飾

在審

• 申請號: 201880046339.1
• 申請日: 2018-07-10
• 公開（公告）號: CN111183226A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: F.陳;X.丁;Y.馮;G.D.戴維斯
• 申請（專利權）人: 西格馬－奧爾德里奇有限責任公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/86;C12N15/11;C12N9/96
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃登高

使用核小體相互作用蛋白結構域以增加可編程DNA修飾蛋白對靶染色體序列的可及性，從而增加在真核細胞中靶向基因組/表觀遺傳修飾的效率的組合物和方法。

領域

本公開內容涉及用于增加靶向基因組修飾、靶向轉錄調節或靶向表觀遺傳修飾的效率的組合物和方法。

背景

可編程內切核酸酶日益成為在真核生物中靶向基因組改造或修飾的重要工具。最近，RNA-指導的成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)系統作為新一代基因組修飾工具出現。與前代的核酸酶例如鋅指核酸酶(ZFN)和轉錄激活物樣效應核酸酶(TALEN)相比，這些新的可編程內切核酸酶提供了空前的簡單性和通用性。然而，真核細胞中的染色質屏障可阻礙原核生物衍生的CRISPR系統的靶標可及性和裂解(Hinz et al, Biochemistry,2015, 54:7063-66; Horlbeck et al., eLife, 2016, 5:e12677)。

事實上，當使用釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9)時，在某些哺乳動物基因組位點上觀察到沒有編輯活性或具有低的編輯活性，迄今為止SpCas9被認為是最具活性的CRISPR核酸酶。此外，迄今為止已被表征的許多CRISPR核酸酶顯示在哺乳動物細胞中沒有活性，即使它們在細菌中或對純化的DNA底物有活性。因此，需要改進CRISPR核酸酶系統和其它可編程DNA修飾蛋白克服染色質阻礙的能力以在真核生物中增加靶向基因組或表觀遺傳修飾的效率。

簡述

在本公開內容的各個方面中提供了融合蛋白，各融合蛋白包含至少一種與可編程DNA修飾蛋白連接的核小體相互作用蛋白結構域。

至少一種核小體相互作用蛋白結構域可以是來自高遷移率族(HMG) box (HMGB)蛋白的DNA結合結構域，所述蛋白選自HMGB1、HMGB2或HMGB3；選自HMGN1、HMGN2、HMGN3a、HMGN3b、HMGN4或HMGN5的HMG核小體-結合(HMGN)蛋白；來自組蛋白H1變體的中央球狀結構域；來自染色質重塑復合物蛋白的DNA結合結構域，所述蛋白選自開關/蔗糖非發酵性(SWI/SNF)復合物、模仿開關(ISWI)復合物、克羅莫結構域-解旋酶-DNA結合(CHD)復合物、核小體重塑和去乙酰基酶(NuRD)復合物、INO80復合物、SWR1復合物、RSC復合物，或其組合。在一些實施方案中，至少一種核小體相互作用蛋白結構域可以是HMGB1 box A結構域、HMGN1蛋白、HMGN2蛋白、HMGN3a蛋白、HMGN3b蛋白、組蛋白H1中央球狀結構域、ISWI蛋白DNA結合結構域、CHD1蛋白DNA結合結構域或其組合。

在一些實施方案中，可編程DNA修飾蛋白具有核酸酶活性，和可編程DNA修飾蛋白可以是成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)核酸酶或切口酶、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活物樣效應核酸酶(TALEN)、大范圍核酸酶或包含與核酸酶結構域連接的可編程DNA結合結構域的嵌合蛋白。

在其它實施方案中，可編程DNA修飾蛋白具有非-核酸酶活性，和可編程DNA修飾蛋白可以是包含與非-核酸酶結構域連接的可編程DNA結合結構域的嵌合蛋白。嵌合蛋白的可編程DNA結合結構域可以是經修飾以缺少所有核酸酶活性的CRISPR蛋白、鋅指蛋白或轉錄激活物-樣效應物，和嵌合蛋白的非-核酸酶結構域可具有乙酰基轉移酶活性、去乙酰基酶活性、甲基轉移酶活性、去甲基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素連接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、去豆蔻酰化活性、瓜氨酸化活性、解旋酶活性、氨基化活性、去氨基化活性、烷基化活性、去烷基化活性、氧化活性、轉錄激活活性或轉錄阻抑活性。在某些實施方案中，嵌合蛋白的非-核酸酶結構域可具有胞嘧啶脫氨酶活性、組蛋白乙酰基轉移酶活性、轉錄激活活性或轉錄阻抑活性。