[發(fā)明專利]用于基因組重排檢測(cè)的測(cè)序方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880045564.3
• 申請(qǐng)日: 2018-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN110869515A
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·科里尼;D·N·羅伯茨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6855
• 分類號(hào): C12Q1/6855;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 羅天樂

本公開涉及用于改進(jìn)檢測(cè)多核苷酸中存在的基因組重排比如缺失、插入、倒位和易位的單端測(cè)序方法。銜接子上的第一引發(fā)事件允許靶序列的測(cè)序，并且第二引發(fā)事件允許鑒定通過選擇性擴(kuò)增而擴(kuò)增和加標(biāo)簽的序列。在相同方向上的引發(fā)事件的組合有助于讀段比對(duì)和任何基因組重排的鑒定。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)主張2017年7月12日提交的美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)15/648,240號(hào)的權(quán)益，在此通過題述并入其全部?jī)?nèi)容。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開涉及用于改進(jìn)基因組重排(諸如融合基因)的檢測(cè)的測(cè)序方法、組合物和試劑盒。本公開還涉及包含基因組重排的靶多核苷酸文庫的制備方法。

背景

已經(jīng)證明使用核酸測(cè)序方法鑒定基因組重排的能力在人類遺傳障礙和疾病的檢測(cè)中是非常有益的。基因組重排通常是指核酸鏈中的任何核苷酸重排，包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入、倒位或易位，并且可以通過對(duì)感興趣的核酸測(cè)序并將序列數(shù)據(jù)與參考(比如已知的核酸序列)比較而加以檢測(cè)。可以使用下一代測(cè)序(NGS)來快速分析多核苷酸并檢測(cè)多核苷酸中的任何基因組重排。NGS允許同時(shí)平行分析大量序列。在一些形式中，將諸如DNA之類的多核苷酸通過一個(gè)或多個(gè)銜接子固定在固體表面上，并擴(kuò)增以增加信號(hào)強(qiáng)度。通常，通過將樣品片段化成多核苷酸片段，用一個(gè)或多個(gè)銜接子將片段加標(biāo)簽，以及擴(kuò)增多核苷酸片段，從而制備用于測(cè)序的文庫。可以用一種或多種擴(kuò)增引物擴(kuò)增片段。在通過合成形式測(cè)序時(shí)，使片段與測(cè)序引物雜交，并且以酶促方式添加標(biāo)記的雙脫氧核苷酸。檢測(cè)并分析來自標(biāo)記的雙脫氧核苷酸的信號(hào)，以確定序列。

可以使用單端或雙端測(cè)序方法分析感興趣的多核苷酸。單端測(cè)序方法涉及從片段的一端向另一端進(jìn)行基因組片段的測(cè)序。單端測(cè)序讀段為每片段提供一個(gè)讀段，所述一個(gè)讀段對(duì)應(yīng)于片段兩端之一的n個(gè)堿基對(duì)，其中n是測(cè)序循環(huán)數(shù)。單端測(cè)序通常不太適合檢測(cè)大規(guī)模基因組重排和重復(fù)序列元件。跨融合連接點(diǎn)的單端讀取為融合事件提供堿基對(duì)證據(jù)。然而，可能難以確保的是，單端讀取已進(jìn)行到足以鑒定融合事件的堿基對(duì)數(shù)目。

雙端方法涉及從一端到另一端讀取核酸片段直至達(dá)到指定的讀長(zhǎng)，然后從片段的另一側(cè)進(jìn)行另一輪讀取。對(duì)于雙端方法，進(jìn)行正向序列讀取和反向序列讀取，并將數(shù)據(jù)配對(duì)為相鄰序列。將序列與參考樣品匹配，以鑒定變體。雙端測(cè)序方法通常用于檢測(cè)基因組重排，因?yàn)檫@樣的方法通常提供良好的定位信息，從而更容易解析基因組中存在的結(jié)構(gòu)重排。然而，許多測(cè)序儀器沒有執(zhí)行雙端測(cè)序的配置，而僅能夠進(jìn)行單端測(cè)序。

WO 2007133831A2論述了使用散布在靶多核苷酸中的銜接子獲得靶序列的核苷酸序列信息的方法和組合物。所述方法可用于在靶多核苷酸或片段內(nèi)的間隔位置插入多個(gè)銜接子。銜接子可以用作使用各種測(cè)序化學(xué)來詢問相鄰序列的平臺(tái)，所述測(cè)序化學(xué)諸如通過引物延伸、探針連接等鑒定核苷酸的那些。本公開包括用于將已知的銜接子序列插入到靶序列中使得連續(xù)的靶序列被銜接子中斷的方法和組合物。本公開指出，通過對(duì)銜接子的“上游”和“下游”兩者測(cè)序，可以完成整個(gè)靶序列的鑒定。

WO2015112974A1論述了與用于制備和分析核酸的方法有關(guān)的方面。在一些實(shí)施方案中，提供了用于序列分析(例如，使用下一代測(cè)序)的核酸的制備方法。

WO2015148219A1論述了一種分析靶核酸片段的方法，所述方法包括使用靶標(biāo)的一條鏈作為模板通過使用第一寡核苷酸引物的引物延伸生成第一鏈，所述第一寡核苷酸引物包含從5'至3'的突出端銜接子區(qū)、引物ID區(qū)、測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)和與靶片段的一端互補(bǔ)的靶標(biāo)特異性序列區(qū)；任選地去除未結(jié)合的引物；從生成的第一鏈擴(kuò)增靶標(biāo)以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。本公開還論述了為什么獨(dú)特的引物可用于這樣的靶分析方法。

使用單端測(cè)序檢測(cè)基因組重排的改進(jìn)方法將對(duì)該領(lǐng)域做出有用的貢獻(xiàn)，特別是如果該方法與高通量測(cè)序分析結(jié)合使用的話。

發(fā)明概述