[發明專利]用于檢測核酸標識符污染的測定方法和組合物

在審

• 申請號: 201880045248.6
• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN110892079A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: K·L·佐貝克;P·安德森;J·奇;H·約翰遜
• 申請（專利權）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 羅天樂

本發明涉及用于大規模平行測序的核酸樣品。更具體地說，本發明涉及用于檢測核酸標識符如樣品條形碼的污染的測定方法、組合物和試劑盒。

相關申請的交叉引用

本申請主張2017年7月10日提交的美國非臨時申請15/645,085號的權益，在此通過題述并入其全部內容。

發明領域

本發明涉及分子生物學領域。具體而言，本發明涉及用于檢測核酸標識符比如樣品條形碼的污染的測定方法和組合物。

發明背景

標識符(例如樣品條形碼或分子條形碼)可以出于多種目的而存在于核酸中。最常見的是，在對這樣的核酸分子進行擴增和/或測序之前，將樣品條形碼添加到感興趣的核酸分子中，以便可以識別序列信息的起源或來源。可以將來自不同樣品的核酸分子合并在一起并進行大規模平行測序，以便有效地確定來自許多不同樣品的序列信息。在測序之前，可以將樣品標識符(通常稱為樣品條形碼)添加到核酸分子中，這有助于信息的分組、分析和解釋。作為另一個實例，可以在擴增之前將分子條形碼添加到靶核酸分子中，使得隨后可以識別初始靶分子的重復并將其分組在一起。

樣品條形碼經常與要通過大規模平行測序進行分析的靶分子一起使用，使得來自不同樣品的核酸分子可以混池(pool)以便測序，并可將序列信息指配給樣品。某些情況下，即使樣品條形碼未被包含在測序池中，執行大規模平行測序的科學家和實驗室也會在池中檢測到樣品條形碼。這表明在混池的核酸中存在污染樣品條形碼，這可能是樣品條形碼試樣中包含不止一種樣品條形碼序列(即期望的條形碼序列和污染條形碼序列)而導致的。污染條形碼可能在樣品條形碼等分試樣制備的任何階段引入，從最早的階段開始，包括DNA寡核苷酸的合成和純化，或者通過在樣品條形碼序列的稀釋和分裝過程中的處理步驟引入。即使當以低頻率(比如1％或更低)存在時，污染樣品條形碼的存在也會導致序列信息的可靠性和解釋方面的問題。

樣品條形碼通常在一組容器(如孔板)中提供，其中每個容器保存不同的樣品條形碼。當樣品條形碼用于實驗室分析時，比如通過將樣品條形碼從其容器中移液到要分析的各種樣品中，存在容器或樣品可能被污染的風險。

通過為每個樣品條形碼制備單獨的測序文庫并將它們單獨測序，可以檢測樣品條形碼的污染。或者，可以使用這樣的混池方案來檢測污染，通過該方案能夠比較至少一個池中的樣品條形碼和另一種樣品條形碼的污染。然而，為了從大量樣品(比如48個或96個樣品)中分離出條形碼，必須準備大量的池并將它們在各自的測序運行中測序。這將是昂貴、低效且費時的。這種方法還有可能在樣品條形碼中錯誤地發現不存在于試管中、而是在許多文庫制備步驟中某一個步驟中引入的污染，從而導致假陽性。

發明概述

作為本發明的一個方面，提供了用于將測定標識符(例如，質量控制條形碼)附接至包含寡核苷酸的一組寡核苷酸樣品的方法，其中每個寡核苷酸包含5'恒定區、樣品標識符(例如樣品條形碼)和3'恒定區，并且在沒有污染的情況下每個樣品標識符在所述組中是唯一的。在一些實施方案中，恒定區包含用于測序平臺的標準擴增區或其反向互補序列。例如，在一些實施方案中，5'恒定區是Illumina Index 1序列，而3'恒定區是Illumina P7序列(P7')的反向互補序列，在其他實施方案中，方向是相反的，使得5'恒定區是Illumina P7序列，而3'恒定區是Illumina Read 2序列。所述方法包括將所述組的每個寡核苷酸樣品在單獨的容器中提供，使得每個容器僅包含一種樣品標識符，除非一個或多個樣品被污染。所述方法還包括用測定引物和第二引物在每個容器中擴增寡核苷酸。測定引物包含一個或多個恒定區(比如P5和Read 1引物序列)、測定標識符和與寡核苷酸的恒定區之一相同或互補的引發部分。除非一個或多個測定引物被污染，否則每個容器僅包含一個測定標識符。因此，所述方法提供了包含測定標識符和樣品標識符的寡核苷酸擴增子。