[發(fā)明專利]用于冷凍電子顯微鏡的氣相樣品制備有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201880040096.0 | 申請日： | 2018-07-06 |
| 公開（公告）號： | CN110799824B | 公開（公告）日： | 2022-07-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | J·庫恩;M·韋斯特法爾 | 申請（專利權(quán)）人： | 威斯康星校友研究基金會 |
| 主分類號： | G01N1/28 | 分類號： | G01N1/28;G01N1/42 |
| 代理公司： | 北京北翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285 | 代理人： | 鄭建暉;鐘守期 |
| 地址： | 美國威*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 冷凍 電子顯微鏡 樣品 制備 | ||
本發(fā)明提供在基體上可控地形成無定形冰和其他無定形固體的層的方法，還提供利用真空下無定形的冰和其他固體形成的冷凍電子顯微鏡(cryo?EM)樣品制備方法和系統(tǒng)。無定形固體層的形成可獨立于待使用電子顯微鏡分析的樣品分子的沉積，并允許產(chǎn)生均勻厚的層。任選地，質(zhì)譜儀器用于產(chǎn)生和純化沉積于所產(chǎn)生的無定形固體層上的分子。本文所述的技術(shù)和系統(tǒng)可實現(xiàn)接近理想的cryo?EM樣品制備，從而大幅提高cryo?EM蛋白成像的分辨率、靈敏度、范圍和通量，因此極大地影響結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域。
本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的GM118110的政府支持下完成的。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
本申請要求2017年7月7日提交的美國臨時專利申請編號62/529,778的優(yōu)先權(quán)，在不與本公開內(nèi)容相抵觸的程度上通過引證將其納入本文。
X射線晶體學(xué)傳統(tǒng)上是為生物學(xué)研究提供結(jié)構(gòu)分析的標準，雖然X射線晶體學(xué)仍提供高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，但是該技術(shù)具有一些缺點。其局限之一為X射線晶體學(xué)需要大量的樣品。這使得X射線晶體學(xué)在難以產(chǎn)生大量、高純度目標分子的情況下并不實用。
單顆粒冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)正在成為對真核細胞、蛋白質(zhì)(150kDa)和大分子復(fù)合物(例如脂質(zhì)體、細胞器和病毒)結(jié)構(gòu)研究的有力替代方法(Stark等人，Microscopy,2016,65(1):23-34))。冷凍電子顯微鏡是獨特的，提供非晶體樣品的3D結(jié)構(gòu)信息，同時也常常需要比X射線晶體學(xué)更少的樣品量。隨著新型電子檢測器的發(fā)展和軟件圖像重建的進步，冷凍電子顯微鏡已接近原子級分辨率，使得許多新的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)成為可能。這項技術(shù)引起了人們相當(dāng)大的興趣，但它仍然存在許多局限性，包括仍然比理論上可行的低四倍的分辨率(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32)。大多數(shù)局限是由于樣品制備導(dǎo)致，樣品制備通常需要純化和玻璃化。將樣品包裹于玻璃態(tài)冰(即無定形冰)中有助于保護樣品免受電子顯微鏡帶來的輻射損傷。理想的樣品玻璃化包括使用無定形冰層，其厚度剛好足以容納感興趣的顆粒。
然而，實際上，樣品玻璃化的過程遠非理想。典型的樣品制備技術(shù)包括蛋白質(zhì)分析物于水中的溶解，然后將其移液至親水性EM網(wǎng)格上。用濾紙將網(wǎng)格吸干(除去99.99％的樣品)，然后將其插入冷凍劑浴中，從而將剩余的水/樣品玻璃化。從電子顯微鏡結(jié)構(gòu)中獲得正確的3D數(shù)據(jù)的關(guān)鍵部分為，所述顆粒必須全部具有相同的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，但必須在無定形冰中隨機取向。正確的3D分析通過大量圖像的重建來完成，因此需要以相同結(jié)構(gòu)構(gòu)象隨機取向的大量顆粒。遺憾的是，當(dāng)前現(xiàn)有的樣品制備技術(shù)賦予了優(yōu)選的顆粒取向(很大程度上是由于顆粒向空氣/水交界面的遷移)，并且顆粒經(jīng)常在空氣-水交界面處變形/拉伸，從而破壞了所需的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。樣品對EM網(wǎng)格基體的吸收也會產(chǎn)生類似的變形。在許多情況下，成像的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性在自然界中是不存在的，并且在沒有分離多個構(gòu)象的方法的情況下，常常無法使用冷凍電子顯微鏡來獲得3D信息(Glaeser,R.M.,Nature Methods,2016,13(1):28-32；和Yu等人，J.Structural biology,2014,187:1-9)。
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