[發(fā)明專利]具有用戶定義的功能的哺乳動物啟動子的計算機設(shè)計

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880039487.0
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN110741086A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A.J.布朗;D.C.詹姆斯;S.J.吉布森;D.哈頓
• 申請（專利權(quán)）人: 免疫醫(yī)療有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6897
• 代理公司: 72001 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 郭慧;彭昶

基因調(diào)控的簡化模型是哺乳動物合成生物學的基本要求。然而，在轉(zhuǎn)錄水平上，這受到控制啟動子活性動力學的復雜設(shè)計規(guī)則的阻礙，從而阻止了從頭設(shè)計具有用戶定義的功能的調(diào)控元件。如本文所證明，當復合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點不能協(xié)同作用時，可以根據(jù)簡單的設(shè)計規(guī)則來構(gòu)建哺乳動物啟動子。對宿主細胞轉(zhuǎn)錄機制組件進行計算機分析，以鑒定具有所需表達動力學的轉(zhuǎn)錄因子。然后在同型和異型結(jié)構(gòu)中全面測試同源結(jié)合位點，以評估模塊性并確定每個位點的單個拷貝表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄活性。當特異性選擇元件以防止組合相互作用時，可以簡單地根據(jù)組成結(jié)合位點拷貝數(shù)對異型啟動子活性準確地建模。因為結(jié)合位點順序、間距和取向?qū)幼踊钚缘挠绊憳O小，因此可以根據(jù)情況特定的設(shè)計標準，在計算機上對區(qū)塊進行最佳組合和排列。為了證明這一點，從頭產(chǎn)生CHO細胞啟動子，這些啟動子在體外表現(xiàn)出設(shè)計的活性水平和長期表達穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了對真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的新見解，并為哺乳動物合成生物學提供了新的工具。

背景技術(shù)

情況特定的啟動子性能是啟動子活性動力學、長期基因表達盒行為(例如沉默的傾向，與其他遺傳組件的相容性(1))和啟動子-細胞相互作用(例如對細胞過程的脫靶效應，例如通過隔離轉(zhuǎn)錄機制組件(2，3))的函數(shù)。鑒于自然進化序列的固有局限性，例如不期望的大小和不可預測的表達動力學，典型地對于大多數(shù)應用而言優(yōu)選合成啟動子。最簡單的合成啟動子構(gòu)建方法涉及通過去除(4，5)、插入(6，7)或突變(8，9)序列元件來增強現(xiàn)有啟動子的功能(有關(guān)合成啟動子構(gòu)建方法的全面綜述，參見(10))。然而，雖然這種策略使得內(nèi)源/病毒啟動子性能逐步改善，但不太可能通過重組工程(re-engineering)針對功能對次優(yōu)起始序列進行全面優(yōu)化。相反，完全合成的構(gòu)建體的自下而上構(gòu)建使得啟動子設(shè)計空間得以大規(guī)模擴展。

完全合成的系統(tǒng)包括合成轉(zhuǎn)錄因子(即鋅指(11)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應子(12)、嵌合體(13)和CRISPR轉(zhuǎn)錄因子(14))，這些轉(zhuǎn)錄因子反式激活包含轉(zhuǎn)錄因子的同源結(jié)合位點(轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件(TFRE))的合成啟動子，這些完全合成的系統(tǒng)施加最小的宿主細胞-啟動子相互作用。然而，相關(guān)的代謝負擔和其他外源重組蛋白的引入可能會限制這些系統(tǒng)在某些應用中的吸引力，諸如基因療法和生物制藥生產(chǎn)。構(gòu)建與宿主細胞的現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄因子(TF)庫相互作用的人工啟動子消除了對輔助TF的需要，但是合成啟動子-內(nèi)源性TF-內(nèi)源性啟動子相互作用組(interactome)可能對合成和內(nèi)源性啟動子兩者的活性動力學產(chǎn)生負面影響(2，3，15)。因此，使用當前可用的啟動子構(gòu)建方法，同時地優(yōu)化啟動子、表達盒和宿主細胞性能是具有挑戰(zhàn)性的。這些相互關(guān)聯(lián)的功能的并行優(yōu)化只能通過計算機定制設(shè)計啟動子(不需要互補的合成TF)來實現(xiàn)。實際上，面向遺傳部件的從頭合成設(shè)計是哺乳動物合成生物學的主要目標。

計算機啟動子設(shè)計受到控制啟動子活性的復雜規(guī)則的限制，這些規(guī)則包括復合TFRE的取向、空間定位和順序，以及其同源TF的功能、表達水平和活性(16，17)。然而，Smith等人最近在成千上萬的人工序列中系統(tǒng)性地測試了TFRE組織的規(guī)則，并發(fā)現(xiàn)啟動子活性主要僅僅是相對TFRE拷貝數(shù)的函數(shù)(18)。這些發(fā)現(xiàn)支持TFRE組織的廣告牌模型，其中在很大程度上可以忽略結(jié)合位點的間距、順序和取向(19，20)。然而，在Smith等人(18)構(gòu)建的啟動子中，活性受到各個TFRE對之間的組合相互作用的影響。當復合TFRE能夠進行協(xié)同和/或干擾相互作用時，TFRE相對順序可能顯著影響啟動子活性，從而大大增加計算機啟動子設(shè)計的復雜性。然而，研究已表明，TF之間的組合相互作用相對罕見(21)。而且，Smith等人僅在用于構(gòu)建啟動子的十二個TFRE中鑒定出八種(可能有六十六種)組合TFRE相互作用(18)。需要選擇不協(xié)作作用的TFRE的方法，以便構(gòu)建具有相對簡單的設(shè)計規(guī)則的啟動子。

發(fā)明內(nèi)容