[發明專利]具有熱穩定性增加的突變型逆轉錄酶以及涉及其的產物、方法和用途

有效

• 申請號: 201880038440.2
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN110709513B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: C.H.貝爾;H.佐貝克;H.瓦爾希;K.安川;M.馬場
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;黃希貴

1.一種相對于SEQ ID NO：1的野生型逆轉錄酶（RT）具有增加的熱穩定性的突變型RT，所述突變型RT包含

i）相對于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六個氨基酸取代的氨基酸序列，其中

- 在位置32處的Ala被Val取代（A32V）；

- 在位置72處的Leu被Arg取代（L72R）；

- 在位置286處的Glu被Arg取代（E286R）；

- 在位置302處的Glu被Lys取代（E302K）；

- 在位置388處的Trp被Arg取代（W388R）；和

- 在位置435處的Leu被Arg取代（L435R），或

ii）與i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定義的六個氨基酸取代的氨基酸序列，

其中所述突變型RT顯示出逆轉錄酶活性。

2.權利要求1的突變型RT，其中所述突變型RT與SEQ ID NO：1的氨基酸序列另外相差在SEQ ID NO：1的N末端處的至多五個氨基酸的缺失、和/或在SEQ ID NO：1的C末端處的至多五個氨基酸的缺失。

3.權利要求1或2的突變型RT，其中所述突變型RT包含氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少96%、97%、98%或99%，特別是100%相同。

4.權利要求1至3中任一項的突變型RT，其中所述突變型RT具有相對于突變型MM3增加的熱穩定性，其中MM3具有與SEQ ID NO：1的氨基酸序列僅相差三個氨基酸取代的氨基酸序列，其中在位置286處的Glu被Arg取代（E286R），在位置302處的Glu被Lys取代（E302K），并且在位置435處的Leu被Arg取代（L435R）。

5.權利要求1-4中任一項的突變型，其中通過測量在熱處理后，特別是在60℃下溫育10分鐘后測量的突變型的逆轉錄酶活性來測定熱穩定性，和/或其中相對于野生型或突變型MM3，熱穩定性增加至少10%、20%、30%或40%，優選至少50%。

6.權利要求1-5中任一項的突變型，其中所述突變型RT的逆轉錄酶活性是野生型的逆轉錄酶活性的至少50%，特別是至少60%，更特別是至少70%，尤其是至少80%，和/或其中所述逆轉錄酶活性通過在37℃下RT介導的dTTP摻入來確定。

7.權利要求1至6中任一項的突變型RT，其與另外的蛋白質融合。

8.一種核酸，其編碼權利要求1至7中任一項的突變型RT。

9.一種細胞，其包含權利要求1至7中任一項的突變型RT或權利要求8的核酸。

10.一種用于執行逆轉錄的試劑盒，其包含權利要求1至7中任一項的突變型RT。

11.權利要求1至7中任一項的突變型RT用于cDNA合成的用途。

12.一種用于RNA逆轉錄的方法，所述方法包括使用權利要求1至7中任一項的突變型RT，從RNA合成cDNA。

13.一種用于檢測樣品中的RNA標記物的方法，

a）在有助于突變型RT活性的條件下，使樣品與權利要求1至7中任一項的突變型RT接觸；

b）使用所述突變型RT，從所述RNA標記物合成cDNA；和

c）檢測步驟b）中合成的cDNA的存在，從而檢測所述樣品中的RNA標記物。

14.權利要求13的方法，其中所述樣品選自體液、血液、血漿、血清、尿、膽汁、腦脊髓液、拭子、臨床樣本、器官樣品和組織樣品，和/或其中所述樣品已得自細胞培養物、懷疑被污染的來源或受試者，特別地其中所述受試者選自人、動物和植物，尤其是人。

15.權利要求13或14的方法，其中所述RNA標記物指示微生物、細胞、病毒、細菌、真菌、哺乳動物物種、遺傳狀況或疾病。