[發明專利]具有熱穩定性增加的突變型逆轉錄酶以及涉及其的產物、方法和用途

有效

• 申請號: 201880038440.2
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN110709513B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: C.H.貝爾;H.佐貝克;H.瓦爾希;K.安川;M.馬場
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;黃希貴

本發明涉及相對于野生型具有增加的熱穩定性的突變型逆轉錄酶（RT），編碼突變型RT的核酸，包含突變型RT或核酸的細胞，包含突變型RT的試劑盒，突變型RT用于cDNA合成的用途，使用突變型RT用于逆轉錄包含合成cDNA的RNA的方法，以及使用突變型RT檢測樣品中的RNA標記物的方法。

本發明涉及相對于野生型具有增加的熱穩定性的突變型逆轉錄酶（RT），編碼突變型RT的核酸，包含所述突變型RT或所述核酸的細胞，包含所述突變型RT的試劑盒，突變型RT用于cDNA合成的用途，使用突變型RT用于逆轉錄包含合成cDNA 的RNA的方法，以及使用突變型RT檢測樣品中的RNA標記物的方法。

逆轉錄酶（RT）[EC 2.7.7.49]是負責病毒基因組復制的酶。它具有RNA和DNA依賴性DNA聚合酶以及RNA酶H活性。來自莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）的RT廣泛用于cDNA合成中，因為它們具有高催化活性和保真度。對于cDNA合成，較高的反應溫度是期望的，因為它減少RNA二級結構和非特異性引物結合。因此，改善RT的熱穩定性是重要目的。MMLV RT的熱穩定性（Kotewicz等人，1985；Gerard等人，2002；Mizuno等人，2010）已通過消除RNA酶H活性得到改善。近年來，MMLV RT的熱穩定性通過以下得到進一步改善：在已牽涉與模板-引物的相互作用的位置處引入正電荷（Yasukawa等人，2010）；隨機誘變（Arezi和Hogrefe，2009；Baranauskas等人，2012），以及將表面疏水性殘基改變成親水性殘基（Konishi等人，2014）。因此，cDNA合成的反應溫度已從37?45℃增加到50?55℃。然而，需要進一步的穩定，以改善cDNA合成的效率。

對于各種酶，已廣泛執行定點誘變和/或隨機突變，并且已鑒定了賦予酶期望特性如增強的催化活性或熱穩定性的各種突變。如果這些突變的效應是累加的，則具有多重突變的變體酶將具有更期望的特性。然而，一般已知在各種酶的活性和穩定性之間存在妥協：增加酶活性的突變伴隨著蛋白質穩定性的降低，并且增加蛋白穩定性的那些突變的確降低了酶活性（Shoichet等人，1995）。另外，目前很難預測突變組合對酶特性的作用。MM3（E286R/E302K/L435R）是熱穩定的MMLV RT三重變體，其通過將旨在增加正電荷的三個突變引入野生型MMLV RT內而生成（Yasukawa等人，2010）。

然而，本發明的目的是提供衍生自MMLV的進一步的熱穩定突變型逆轉錄酶。

為此，設計了29個突變。在大腸桿菌（Escherichia coli）中產生相應的單個變體，并且表征活性和穩定性，并且選擇了六個突變（Ala32→Val、Leu41→Asp、Leu72→Arg、Ile212→Arg、Leu272→Glu和Trp388→Arg）。通過將六個突變中的一個或多個與MM3突變結合，設計了15種多重變體。產生并表征了相應的多重變體。六重變體MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）顯示出比野生型或突變型MM3更高的熱穩定性（參見實施例2以及圖4E、4F、5和6）。

相應地，在第一個方面，本發明涉及相對于SEQ ID NO：1的野生型RT具有增加的熱穩定性的突變型逆轉錄酶（RT），所述突變型RT包含：

i）相對于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六個氨基酸取代的氨基酸序列，其中

- 在位置32處的Ala被Val取代（A32V）；

- 在位置72處的Leu被Arg取代（L72R）；

- 在位置286處的Glu被Arg取代（E286R）；

- 在位置302處的Glu被Lys取代（E302K）；

- 在位置388處的Trp被Arg取代（W388R）；和

- 在位置435處的Leu被Arg取代（L435R），或