[發明專利]用于純化源自人胚胎干細胞的內胚層和胰腺內胚層細胞的方法

在審

• 申請號: 201880038434.7
• 申請日: 2018-06-14
• 公開（公告）號: CN111094547A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: H·利克特;P·馬哈達卡爾;S·M·諾貝爾
• 申請（專利權）人: 德國亥姆霍茲慕尼黑中心健康與環境研究中心(有限公司);米特尼生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;丁磊

本發明涉及從源自多能干細胞、誘導多能干細胞和胚胎干細胞的細胞群中富集胰腺祖細胞的方法。本文公開了用于富集胰腺祖細胞的標志物CD51和CD177，以及用于富集或耗竭肝臟祖細胞的標志物CD275。

背景技術

由自身免疫反應引起的胰島中β-細胞破壞是I型糖尿病的病因，但在II型糖尿病中，盡管是由其它機制介導的，但是該種疾病的晚期也可能發生β-細胞破壞。然而，患有這些疾病(尤其是I型糖尿病)的患者需要外源性胰島素輸送，但是選擇正確的胰島素劑量仍然是一個挑戰，并可能導致血糖控制不佳。

胰島的再生能力是非常有限的，因此胰島細胞的移植可以改善葡萄糖耐量和控制。然而，胰島細胞移植具有不同的局限性，這種局限性包括對供體器官的依賴、自胰腺中分離胰島的挑戰及終身使用免疫抑制藥物。多能干細胞為供體胰島細胞的不足提供了一種可能的解決方案。

現有技術中已經描述了若干用于將多能干細胞或胚胎干細胞分化為胰腺祖細胞或β-細胞的方法。例如Rezania等2014、Pagliuca等2014、D’Amour等2006或Kroon等2008。盡管所有這些方法都得到了相當比例的β-細胞，但通過這些方法產生的β-細胞是不成熟的，并且還可能包含一些未分化的多能干細胞，這些未分化的多能干細胞可能帶來畸胎瘤形成的風險。

因此，在分化過程中富集細胞亞群，從而得到更大比例的胰腺祖細胞是非常重要的。在胰腺和胰島發育過程中，細胞會經歷各種中間體。一個重要的中間體是前定形內胚層(anterior definitive endoderm,ADE)的階段。在本文中可以區分發育為胰腺譜系或其他譜系(如肝臟)的已特化亞群。專利申請US 2009/0263896A1和WO2016/170069A1公開了若干用于富集胰腺內胚層細胞的標志物。然而，這些專利申請在向胰腺β-細胞分化的后期階段才對亞群進行分選。這些細胞使細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑上調，并失去了擴增大量細胞以用于細胞替代療法的潛力。在ADE階段即細胞仍然高度增殖時對胰腺祖細胞進行分選將克服上述擴增難題并允許自多能干細胞的大量胰腺祖細胞的可擴展生產。

然而，仍然需要分化早期的具有胰腺命運(fate)的定形內胚層亞群的可靠且優選地是改善的標志物，由此理想地改善自異質細胞群中選擇特化的胰腺祖細胞，所述胰腺祖細胞有利地在隨后的制備過程中仍然具有增殖的能力。因此，本申請所基于的技術問題是滿足上述需求。本發明的發明人驚訝地發現，可以將細胞表面標志物CD51和/或CD177用于在定形內胚層階段富集未來的胰腺祖細胞，而可以將細胞表面標志物CD275用于富集未來的肝譜系細胞或用于耗竭此類細胞。肝譜系細胞的耗竭可以用于移除不發育為胰腺祖細胞的細胞，由此富集能夠發育為胰腺祖細胞的細胞。此外，可以將畸胎瘤形成細胞分出并且CD177和CD275可作為評估不同細胞系和不同方案中分化過程的工具。CD177亞群還顯示出增加的WNT/平面細胞極性(PCP)信號傳導。CD177+細胞顯示出β-連環蛋白向膜的易位，因此促進了胰腺命運而非肝臟命運(實施例2和4，圖2C-E，圖4D)。CD177+細胞有效地生成了背側胰腺(dorsal pancreas)(實施例3和7，圖3C、D)，產生更緊密的簇并且具有組織極性(實施例5，圖5E)。這些細胞顯示出胰腺轉錄因子如PDX1或NKX6.1的更高表達(實施例5和9，圖5C)并產生單激素細胞(實施例5和9，圖5B)。此外，如實施例2、6和7所示，與現有技術中已知的CXCR4陽性細胞(CD184)相比，CD177陽性細胞產生的細胞群具有成為胰腺祖細胞的更高可能性。

發明概述

本文描述的實施方案涉及用于純化源自多能干細胞、誘導多能干細胞和/或胚胎干細胞的胰腺祖細胞的方法，和包含所述純化的胰腺祖細胞的組合物以及包含針對CD177的配體和用于將胰腺祖細胞分化為定形內胚層細胞群的手段的試劑盒。

因此，本發明涉及一種純化胰腺祖細胞的方法，包括：