[發明專利]用于制備核酸文庫的方法和組合物

有效

• 申請號: 201880031331.8
• 申請日: 2018-03-16
• 公開（公告）號: CN110612351B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 陳錫君;塔倫·庫拉納
• 申請（專利權）人: ILLUMINA公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本文提供的系統、方法和組合物涉及制備核酸文庫。一些實施方案包括通過連接單鏈核酸制備核酸文庫。

相關申請

本申請要求2017年3月20日提交的名稱為“用于制備核酸文庫的方法和組合物”的美國臨時申請62/473595號的優先權；將其公開的內容通過援引的方式整體并入本文。

序列表

本申請包含電子格式的序列表。所提供的序列表文件名為“ILLINC362WOSEQLIST”，創建于2018年3月15日，其文件大小約為4kb。將電子格式序列表中的信息通過援引的方式整體并入本文。

發明領域

本文提供的系統、方法和組合物涉及制備核酸文庫。一些實施方案包括通過連接單鏈核酸制備核酸文庫。

發明背景

數種二代測序技術可用于快速、經濟地確定基因組的整個序列。通常，在測序前由雙鏈靶基因組DNA樣品制備模板核酸文庫。樣品制備通常包括DNA片段化步驟，將較大的DNA鏈斷裂為較小的DNA片段，較小的DNA片段更適合于二代測序技術。通常，銜接子附接在DNA片段的末端，這可以通過在DNA末端修復后進行銜接子連接來完成，或者最近通過使用轉座體系統來完成。轉座體是轉座酶和轉座子序列的復合體，使用轉座體可以同時進行基因組片段化和片段的銜接子連接，從而簡化了文庫的制備。文庫制備方法通常是勞動密集型的，并且在不同的階段需要幾個動手步驟。

發明概述

一些實施方案包括制備核酸文庫的方法，包括：(a)獲取多個核酸，其中所述多個核酸是單鏈核酸；(b)將所述單鏈核酸的5′端去磷酸化；(c)在連接酶存在下，將第一銜接子與所述單鏈核酸的3′端連接，其中所述第一銜接子的3′端包含封閉基團；(d)使所述連接的單鏈核酸的5′端磷酸化；以及(e)在所述連接酶存在下，將第二銜接子與所述磷酸化的連接的單鏈核酸的5′端連接，從而得到核酸文庫。

在一些實施方案中，所述第二銜接子的5′端是非磷酸化的。

在一些實施方案中，所述第二銜接子附接于基底。在一些實施方案中，所述基底包含珠或流動室。

一些實施方案還包括在步驟(e)之前去除未連接的單鏈第一銜接子。

一些實施方案還包括使所述未連接的單鏈第一銜接子與捕獲探針雜交。在一些實施方案中，所述捕獲探針包含與所述第一銜接子的至少一部分互補的序列。在一些實施方案中，所述捕獲探針的3′端包含封閉基團。在一些實施方案中，所述捕獲探針的5′端包含封閉基團。

一些實施方案還包括消化所述未連接的單鏈第一銜接子。在一些實施方案中，消化所述未連接的單鏈第一銜接子包括使所述未連接的單鏈第一銜接子與5′-磷酸依賴性核酸外切酶接觸。在一些實施方案中，消化所述未連接的單鏈第一銜接子包括使所述未連接的單鏈第一銜接子與5′-磷酸依賴性核酸外切酶和5′-去腺苷化酶接觸。

在一些實施方案中，使所述連接的單鏈核酸的5′端磷酸化包括使所述連接的單鏈核酸與激酶接觸。

一些實施方案包括制備核酸文庫的方法，包括：(a)獲取多個核酸，其中所述多個核酸是雙鏈核酸；(b)使所述雙鏈核酸與5′-核酸外切酶接觸，以獲取多個具有單鏈3′-懸突的修飾的雙鏈核酸；(c)在連接酶存在下，使第一銜接子與所述修飾的雙鏈核酸的3′端連接，其中所述第一銜接子的3′端包含封閉基團；(d)使與所述第一銜接子連接的所述修飾的雙鏈核酸去雜交(dehybridizing)，以獲取多個單鏈核酸；以及(e)在所述連接酶存在下，使第二銜接子與所述單鏈核酸的5′端連接，從而得到核酸文庫。

在一些實施方案中，所述第二銜接子的5′端是非磷酸化的。