[發(fā)明專利]用于制備核酸文庫的方法和組合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880031331.8
• 申請(qǐng)日: 2018-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN110612351B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳錫君;塔倫·庫拉納
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: ILLUMINA公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

1.制備核酸文庫的方法，包括：

(a)?獲取多個(gè)核酸，其中所述多個(gè)核酸是單鏈核酸；

(b)?將所述單鏈核酸的5′端脫磷酸化；

(c)?在連接酶存在下，將第一銜接子與所述單鏈核酸的3′端連接，其中所述第一銜接子的3′端包含封閉基團(tuán)；

(d)?通過使未連接的單鏈第一銜接子與捕獲探針雜交，去除未連接的單鏈第一銜接子；

(e)?使所述連接的單鏈核酸的5′端磷酸化；以及

(f)?在所述連接酶存在下，將第二銜接子與所述磷酸化的連接的單鏈核酸的5′端連接，從而得到核酸文庫，

其中所述捕獲探針的3′端和5′端包含封閉基團(tuán)。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二銜接子的5′端是非磷酸化的。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二銜接子附接于基底。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述基底包含珠或流動(dòng)室。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲探針位于溶液中。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲探針包含與所述第一銜接子的至少一部分互補(bǔ)的序列。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使所述連接的單鏈核酸的5′端磷酸化包括使所述連接的單鏈核酸與激酶接觸。

8.?如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)?–?(f)在單個(gè)反應(yīng)體積中進(jìn)行。

9.?如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)?–?(f)在單個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行。

10.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一銜接子和/或第二銜接子包含測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第一銜接子包含P7序列、P5序列或者其互補(bǔ)序列或反向互補(bǔ)序列。

12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第二銜接子包含P7序列、P5序列或者其互補(bǔ)序列或反向互補(bǔ)序列。

13.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一銜接子和/或第二銜接子包含銜接子索引。

14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一銜接子索引不同于所述第二銜接子索引。

15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述銜接子索引指示所述多個(gè)核酸的來源。

16.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述封閉基團(tuán)包含3'-間隔子C3或雙脫氧核苷酸。

17.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述連接酶包含單鏈核酸連接酶。

18.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一銜接子的連接和/或所述第二銜接子的連接是在體積排除試劑存在下進(jìn)行的。

19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述體積排除試劑選自：聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、羥乙基淀粉、Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮。

20.?如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一連接步驟和/或第二連接步驟在包含至少37%?(wt/vol)?PEG的反應(yīng)體積中進(jìn)行。

21.?如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一連接步驟和/或第二連接步驟在包含至少60%?(wt/vol)?PEG的反應(yīng)體積中進(jìn)行。