[發明專利]高靈敏度DNA甲基化分析方法

在審

• 申請號: 201880026692.3
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN111183145A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 何川;普拉德尼亞·納爾赫德;趙伯譞;劉暢;崔曉龍
• 申請（專利權）人: 芝加哥大學
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C12P19/34;C12Q1/6844;G01N33/50;G01N33/574
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王春偉;劉繼富

提供了用于擴增一定量的基因組甲基化DNA的方法、組合物和試劑盒，該基因組甲基化DNA可進行隨后分析和/或測序。其特別適用于少量DNA，包括但不限于無細胞DNA樣品。在一些實施方案中，控制聚合酶和甲基轉移酶的比例以提供最大收率。在一些實施方案中，使用雙重的引發酶/聚合酶。

相關申請的交叉引用

本申請要求2017年3月8日提交的美國臨時專利申請第62/468,907號的優先權，其整體內容通過引用并入此文。

發明背景

本發明是在由美國國立衛生研究院授予的批準號AR048177下利用政府支持完成的。政府擁有本發明的一定權利。

1.技術領域

本發明一般涉及分子生物學。更具體地，在一些實施方案中，本發明涉及用于定量或單堿基分辨率分析有限生物樣品中的DNA甲基化(5-甲基胞嘧啶，5mC)的組合物和方法，所述有限生物樣品包括來自低細胞數細胞或單細胞的DNA和來自血液或其他體液樣品的無細胞DNA(cfDNA)，所述方法在全基因組擴增過程中或在通過定量PCR或高通量測序檢測之前擴增特定DNA片段或基因座的過程中使用與鏈置換DNA聚合酶偶聯的DNMT1，以保存5mC信息。

2.背景技術

胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸中胞嘧啶堿基的基因組甲基化是涉及細胞類型特異性轉錄模式調節的關鍵表觀遺傳機制。因此，以單堿基分辨率繪制DNA甲基化組的圖譜為表觀遺傳調控在發育和疾病中的參與提供了許多有力的見解。由于給定群體內細胞的甲基化譜之間通常具有顯著的差異程度，來自大量組織樣品的信息可能無法解釋由細胞間變異引起的表觀基因組的組織異質性；因此，大量數據可能掩蓋單個細胞對生化過程的不同貢獻。因此，以高準確度和CpG覆蓋率進行單細胞全甲基化組分析的能力將能夠對大量樣品進行反卷積，以更深入地研究DNA甲基化發揮作用的各種生物活性，包括但不限于早期胚胎發育和細胞分化、誘導多能干細胞的產生、癌癥進展和轉移、免疫宿主防御反應和神經元可塑性。

另一方面，源自癌癥患者腫瘤的血漿中的循環cfDNA的發現為基于血液的非侵入性癌癥檢測測試開辟了新的途徑。然而，由于從血漿中提取的cfDNA的經降解的小尺寸和低濃度，cfDNA中的5mC模式的表征在技術上的要求一直很苛刻。因此，可測量有限細胞數或甚至單細胞水平的甲基化組測定方法另外可用于表征小的或少量細胞群和DNA的微小樣品例如皮克水平量的cfDNA以及來自活組織檢查或患者樣品的基因組DNA。目前的方法提供了從基因組DNA或cfDNA如實地擴增甲基化組的方法。