[發明專利]高靈敏度DNA甲基化分析方法

在審

• 申請號: 201880026692.3
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN111183145A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 何川;普拉德尼亞·納爾赫德;趙伯譞;劉暢;崔曉龍
• 申請（專利權）人: 芝加哥大學
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C12P19/34;C12Q1/6844;G01N33/50;G01N33/574
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王春偉;劉繼富

1.一種擴增目標甲基化基因組DNA的方法，其包括：

a)使目標甲基化基因組DNA變性；

b)在用于復制所述目標甲基化基因組DNA并產生擴增的基因組甲基化DNA分子的條件下，將所述目標甲基化基因組DNA與聚合酶和甲基轉移酶一起孵育；和，

c)分離擴增的基因組甲基化DNA分子。

2.根據權利要求1所述的方法，其中聚合酶單位與甲基轉移酶單位的比例為約1:5至約1:20。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述比例為約1單位:15單位。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中與聚合酶和甲基轉移酶一起孵育的目標基因組甲基化DNA的量為約5皮克(pg)至約1微克(μg)。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述目標基因組甲基化DNA獲自組織樣品、血清樣品、血液樣品、糞便樣品、尿液樣品、或面頰或口腔拭子。

6.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中變性涉及堿性變性。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述聚合酶為鏈置換聚合酶。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述聚合酶為Phi29或其衍生物。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述甲基轉移酶可以在半甲基化DNA上安置5mC以達到完全甲基化狀態。

10.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述甲基轉移酶是DNMT1。

11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中步驟b)還包括將所述目標甲基化基因組DNA與包含引發酶和聚合酶雙重活性的酶一起孵育，以在復制目標甲基化基因組DNA并產生擴增的基因組甲基化DNA分子的條件期間合成引物。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述酶來自嗜熱棲熱菌。

13.根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其還包括在進行步驟b)的孵育之前，制備單獨的主混合物以及包含聚合酶和甲基轉移酶的酶混合物。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含具有引發酶和聚合酶雙重活性的酶。

15.根據權利要求14所述的方法，其中所述酶來自嗜熱棲熱菌。

16.根據權利要求13所述的方法，其中所述酶混合物還包含甲基輔因子。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述甲基輔因子是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。

18.根據權利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含dNTP、DNA緩沖液和鎂。

19.根據權利要求11至18中任一項所述的方法，其中在將主混合物與酶混合物混合之前，將目標基因組甲基化DNA和隨機引物加入到主混合物中。

20.根據權利要求1至18中任一項所述的方法，其還包括在步驟b)的孵育開始超過3小時后加入更多的甲基輔因子。

21.根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其還包括使聚合酶和/或甲基轉移酶失活。

22.根據權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述基因組甲基化DNA分子來自人類患者。