[發明專利]通用發夾引物

在審

• 申請號: 201880020455.6
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN110446787A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: T·拉孜;P·瑪麗
• 申請（專利權）人: 生物輻射實驗室股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/682;C12Q1/6848;C12Q1/6869;C12Q1/6876;C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;陳揚揚

本發明涉及靶核酸擴增的方法及其在測序方法或其他下游應用諸如基因分型或克隆中的用途。更具體地，該方法涉及通過使用通用發夾引物擴增靶核酸的方法。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2017年3月24日提交的美國臨時申請號62/476,108的優先權，其通過引用全文納入本文用于所有目的。

以ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或計算機程序表附頁的引用

將2018年3月19日于機器型號IBM-PC，MS-Windows操作系統創建的1,028字節的文件097505-113810PC-1079936_SequenceListing.txt中所記載的序列表全文納入本文用于所有目的。

背景技術

擴增感興趣的靶核酸有許多方法。這些方法中的一些，諸如PCR和其衍生方法，廣泛應用于分子生物學領域。PCR是一種敏感且特異性的試驗，其能夠在大量非靶核酸材料中檢測微量靶核酸序列。例如，已知基于PCR的方法，用于檢測少量DNA諸如來自孕婦血漿樣品的無細胞DNA以篩選胎兒非整倍性或檢測癌癥患者血液樣品中的循環腫瘤DNA(ctDNA)，參見例如，美國專利申請號20150147815、20150087535和20160138112，以及美國專利號9,334,541和9,499,870，其公開通過引用納入本文。

PCR原理的持續擴張使得許多公司投入大量資源來簡化核酸文庫的制備程序和擴增過程，例如，在水性溶液、微滴、乳液和基于固相的核酸擴增中進行反應(例如，億明達有限公司(Illumina Inc.)，離子激流公司(Ion Torrent)，454生物科學公司(454LifeSciences)和太平洋生物科學公司(Pacific Biosciences))。核酸擴增方法的進一步改進導致多重核酸擴增反應的發展，能夠在單個反應混合物中擴增數百或數千種核酸靶標，參見例如，美國專利申請號20160369333和美國專利號8,673,560和8,728,728，其公開通過引用納入本文。相應地，設計引物及其在核酸擴增反應中的功能對于預防和/或降低錯誤引發和/或失敗引發事件的可能性，多重核酸擴增反應的開發以及需要較少優化單個引物濃度而言是十分重要的，因為核酸擴增反應的參數變得更加協調。

核酸擴增反應引物設計的一些參數在本領域中充分記載，諸如百分比GC含量，引物長度，退火和解鏈溫度，5’端穩定性和3’端特異性(Dieffenbach等，述于《PCR方法和應用》(PCR Methods and Applications)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory)，3:S30-S37(1993))。引物設計的另一考慮因素是二級結構的存在，如發夾(莖環)或引物二聚體。通過限制引物引發的可用性及其結合感興趣的靶核酸的能力，發夾可以大幅度地降低PCR反應的效率。因為存在于引物二級結構內的互補核酸序列，這些二級結構導致失敗、不成比例或無效率的核酸擴增。存在這樣的多種算法，其允許用戶輸入潛在的引物設計以確定二級結構的存在(例如，NCBI BLAST-Primer軟件、Primer3Plus軟件)。通常，舍棄具有顯著二級結構的引物，傾向于缺少二級結構的類似引物，以使核酸擴增反應的效率最大化(參見例如，Singh等,Mol Biol.,1(3):67-69(2000))。因此，我們提供了改進的方法、試劑盒和反應混合物，用于擴增核酸。

發明概述

本文提供用于核酸擴增的方法、試劑盒和反應混合物。該方法包括使用第一靶引物對和通用引物對，所述第一靶引物對包含一種或兩種靶特異性發夾引物，所述靶特異性發夾引物具有：(i)3'單鏈靶特異性區，當其處于或低于Tm溫度時，(ii)5'區，其在低于Tm溫度時形成發夾而在高于Tm溫度時不形成所述發夾；所述通用引物對包含一種或兩種這樣的發夾引物，所述發夾引物具有所述5'區并且沒有單鏈3'端，據在低于Tm溫度時所確定。在一些實施方式中，在低于形成發夾的5'區Tm溫度的溫度時，第一靶引物對的3'單鏈靶特異性區是單鏈。在一些實施方式中，在高于、低于或等于形成發夾的5'區Tm溫度的溫度時，3'單鏈靶特異性區是單鏈。