[發(fā)明專利]通用發(fā)夾引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880020455.6
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN110446787A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: T·拉孜;P·瑪麗
• 申請（專利權(quán)）人: 生物輻射實驗室股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/682;C12Q1/6848;C12Q1/6869;C12Q1/6876;C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;陳揚揚

1.一種靶核酸擴增的方法，其包括：

(1)將第一靶核酸與下述物質(zhì)混合：

(a)第一靶引物對，所述第一靶引物對包含一種或兩種第一靶特異性發(fā)夾引物，所述發(fā)夾引物具有：

(i)3’單鏈靶特異性區(qū)，當(dāng)其處于或低于Tm溫度時，和

(ii)5’區(qū)，其在低于Tm溫度時形成發(fā)夾而在高于Tm溫度時不形成所述發(fā)夾，其中所述5’區(qū)包含通用銜接子序列，和

(b)通用引物對，所述通用引物對包含一種或兩種通用發(fā)夾引物，所述通用發(fā)夾引物：

(i)具有所述5’區(qū)，并且

(ii)沒有單鏈3'端，據(jù)在低于Tm溫度時所確定；

(2)以處于或低于Tm溫度的溫度將來自所述第一靶引物對的至少一種第一靶特異性發(fā)夾引物的3’單鏈靶特異性區(qū)退火至所述第一靶核酸，并用聚合酶以模板依賴性方式延伸所述靶特異性發(fā)夾引物，以形成包含一條或兩條通用銜接子序列的第一擴增子；

(3)將所述第一擴增子變性成兩條核酸鏈；

(4)以高于所述Tm溫度的溫度將所述一種或兩種通用發(fā)夾引物退火至所述第一擴增子中一條鏈的通用銜接子序列；

(5)用聚合酶以模板依賴性方式延伸所述一種或兩種通用發(fā)夾引物，以形成第二擴增子，從而擴增所述第一靶核酸。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一靶引物對包含兩種靶特異性發(fā)夾引物或者所述通用引物對包含兩種通用發(fā)夾引物。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，重復(fù)多次步驟(2)和(3)。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述第一靶引物對在步驟(4)之前耗盡。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，至少一種通用發(fā)夾引物與標(biāo)簽連接，從而使所述標(biāo)簽納入所述第二擴增子，或者所述第一靶引物對不與標(biāo)簽連接。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述Tm溫度比所述第一靶特異性發(fā)夾引物的Tm溫度低至少2℃。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述混合進一步包括混合第二靶引物對，所述第二靶引物對包含一種或兩種第二靶特異性發(fā)夾引物，所述第二發(fā)夾引物具有：

(i)3’單鏈靶特異性區(qū)，其不同于所述第一靶特異性發(fā)夾引物的3’單鏈靶特異性區(qū)，和

(ii)所述5’區(qū)；

步驟(2)包括以處于或低于Tm溫度的溫度將來自所述第二靶引物對的至少一種第二靶特異性發(fā)夾引物退火至第二靶核酸，并用聚合酶以模板依賴性方式延伸所述第二靶特異性發(fā)夾引物，以形成包含一條或兩條通用銜接子序列的第一延伸產(chǎn)物，

步驟(3)包括將所述第一延伸產(chǎn)物變性成兩條核酸鏈；

(4)以高于所述Tm溫度的溫度將所述一種或兩種通用發(fā)夾引物退火至所述第一延伸產(chǎn)物中一條鏈的通用銜接子序列；

(5)用聚合酶以模板依賴性方式延伸所述一種或兩種通用發(fā)夾引物，以形成第二延伸產(chǎn)物，從而擴增所述第二靶核酸。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述第二靶引物對包含兩種靶特異性發(fā)夾引物或者所述一種或兩種通用發(fā)夾引物包含兩種通用發(fā)夾引物。

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述混合還包括混合1-10、1-20、1-30、1-40或1-50種其他靶引物對，其中所述其他靶引物對包含一種或兩種靶特異性發(fā)夾引物，所述靶特異性發(fā)夾引物具有：(i)3’單鏈靶特異性區(qū)，其不同于混合物中任何其他靶特異性發(fā)夾引物的3’單鏈靶特異性區(qū)，和(ii)所述5’區(qū)；其中對第一、第二和其他靶特異性發(fā)夾引物進行步驟(2)到(5)，從而擴增所述靶核酸。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸擴增在微滴中進行。