[發明專利]一種體外糖基工程化紅細胞生成刺激蛋白的方法

在審

• 申請號: 201880019358.5
• 申請日: 2018-03-16
• 公開（公告）號: CN110446499A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: M·邁爾;M·托曼
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: A61K38/18
• 分類號: A61K38/18
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

本發明涉及一種體外生產糖基工程化的紅細胞生成刺激蛋白的方法，包括以下步驟：提供不含唾液酸的紅細胞生成刺激蛋白、用N?乙酰基?葡萄糖胺轉移酶B3GNT2處理紅細胞生成刺激蛋白、用半乳糖基轉移酶處理紅細胞生成刺激蛋白、和用唾液酸轉移酶處理紅細胞生成刺激蛋白。

技術領域

本發明涉及體外糖基工程化(glycoengineered)的紅細胞生成刺激蛋白、產生所述紅細胞生成刺激蛋白的方法及其用途。

背景技術

紅細胞生成刺激蛋白是包含幾個N-糖基化位點的糖蛋白。蛋白質上聚糖模式的變異對蛋白質功能具有重要意義。例如，蛋白質上N-連接的聚糖結構可影響各種特征，包括蛋白酶易感性、細胞內運輸、分泌、組織靶向、生物半衰期和細胞或生物體中蛋白質的抗原性。這些特征中的一種或多種的改變極大地影響蛋白質在其天然環境中的功效，并且在為治療劑的目的生產肽的情況下，其還影響蛋白質作為治療劑的功效。

紅細胞生成素(EPO)是具有三個N-糖基化位點和一個O-糖基化位點的糖蛋白。已經使用重組DNA技術生物合成制備紅細胞生成素(Egrie,J C,Strickland,T W,Lane,J等人(1986)Immunobiol.72:213–224)，其是插入中國倉鼠的卵巢組織細胞(CHO細胞)中并在其中表達的克隆人EPO基因的產物。人紅細胞生成素(hEPO)的主要、完全加工形式的一級結構如圖1所示。有兩個二硫鍵；在Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之間。不含糖部分的EPO多肽鏈的分子量為18,236Da。在完整的EPO糖蛋白中，大約40％的分子量由碳水化合物基團所占，所述碳水化合物基團在蛋白質糖基化位點上的糖基化蛋白質(Sasaki,H,Bothner,B,Dell,Aand Fukuda,M(1987)J.Biol.Chem.262:12059)。

EPO的典型N-聚糖包括具有一個或兩個N-乙酰基乳糖胺重復的雙、三和四觸角結構(參見例如Postnikov等人2016Russ.Chem.Rev.85 99)。

已知與較少唾液酸化的EPO糖蛋白相比，EPO的N-聚糖上更多數量的末端唾液酸部分與更高的EPO比活性相關(參見例如Imai等人,Eur.J.Biochem.194(1990)，第457-462頁)。EPO的去唾液酸化降低了EPO在循環中的半衰期(Ridley等人J Natl MedAssoc.1994Feb；86(2):129-35)。

據報道，更多數量的聚-N-乙酰基乳糖胺重復或更多數量的EPO的N-聚糖分支都分別與EPO更高的比生物學活性相關(參見例如WO 99/28346)。

已知使用基因工程化的宿主細胞修飾EPO的聚糖模式以產生EPO，例如WO 99/28346。

提出了在體外修飾糖蛋白聚糖模式的方法，即生產后修飾聚糖模式。EP 2661492公開了一種改善α-2,6-唾液酸化聚糖的含量的方法。EP 2664192公開了通過增加聚-N-乙酰基乳糖胺的數量可以增加糖蛋白的循環時間，其建議使用β3-N-乙酰基-葡萄糖胺轉移酶家族成員(B3GNT1、2、3、4)來實現聚-N-乙酰基乳糖胺的數量增加。

WO 2008/57683公開了一種純化EPO的方法。其建議在體外使用N-乙酰基-葡萄糖胺轉移酶和半乳糖基轉移酶重構EPO的聚糖模式，以形成糖基化的EPO多肽，其具有至少一個具有末端-GlcNAc-Gal部分的聚糖殘基，優選在單觸角分支上。