[發明專利]新型整合位點及其用途

在審

• 申請號: 201880018555.5
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN110431227A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 孔令潔;R·雁如·蔡;遲秀玲
• 申請（專利權）人: 應用干細胞有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/00;C12N15/09;C12N15/11
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 張怡;杜丹

本公開內容提供了用于增強外源性基因在真核細胞中表達的組合物和方法。還提供了用于增強的和穩定的外源性基因表達的染色體基因座和序列。

相關申請的交叉引用

本申請要求2017年3月19日提交的美國臨時專利申請號62/473,454的優先權，其所公開的全部內容在此參考并入。

發明領域

本發明一般地涉及用于增強蛋白在真核細胞中的表達的組合物和方法。

背景技術

在哺乳動物細胞中生產重組蛋白對于研究或治療用途非常重要。產生能夠高水平且穩定表達重組蛋白的哺乳動物細胞系是生產工藝中的關鍵步驟。產生此類哺乳動物細胞系的最常用方法包括下述步驟：1)將包含轉基因的載體轉染進入哺乳動物細胞，以使得轉基因可以并入細胞的染色體內，和2)選擇高水平表達轉基因的細胞。適于生產目的的穩定轉染細胞系的選擇通常是一個艱難的過程，因為表達的維持高度依賴于轉基因整合位點基因組環境的性質，其中在絕大多數情況下表觀遺傳機制導致表達變異和沉默。因此，本領域對改進的哺乳動物表達系統存在持續的需求。

發明概述

在一個方面中，本公開內容提供了一種哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞包含整合在所述細胞的基因組基因座內的外源性核酸序列，其中所述基因座包含延伸的無甲基化CpG島。在一個實施方式中，所述基因座是選自下組的基因組區域：核不均一核糖核蛋白A2(hnRNPA2)的啟動子和周圍區域、TATA結合蛋白(TBP)的啟動子和周圍區域、β-肌動蛋白的CpG島/啟動子和周圍區域以及PDCD2的CpG島/啟動子和周圍區域。在一個實施方式中，所述基因座包含與SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:1對應于中國倉鼠基因組中的hnRNPA2 CpG島/啟動子基因座。在一個實施方式中，所述基因座包含與SEQID NO:2具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:2對應于人基因組中的hnRNPA2CpG島/啟動子基因座。在一個實施方式中，所述基因座包含與SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:3對應于小鼠基因組中的hnRNPA2 CpG島/啟動子基因座。

在一個實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方式中，所述細胞是CHO細胞。在一個實施方式中，所述細胞是ES細胞或受精卵。

在一個實施方式中，所述外源性核酸序列包含外源性目標基因(GOI)。在一個實施方式中，所述外源性核酸序列包含外源性啟動子。在一個實施方式中，所述外源性核酸編碼蛋白。在一個實施方式中，所述外源性核酸編碼抗體。在一個實施方式中，所述外源性核酸序列包含一個或多個重組酶識別序列。在一個實施方式中，所述重組酶識別序列選自下組：attP位點、attB、LoxP位點、Lox511位點、Lox2272位點、Lox2372位點、Lox5171位點、Loxm2位點、Lox71位點、Lox66位點、LoxFas位點、frt位點、由phiC31整合酶識別的位點、由Bxb1整合酶識別的位點和由Tn3整合酶識別的位點。

在另一個方面中，本公開內容提供了一種方法，所述方法包括：將外源性核酸引入哺乳動物細胞，其中將所述外源性核酸整合至所述基因組的基因座，所述基因座包含延伸的無甲基化CpG島。在一個實施方式中，所述方法還包括將所述細胞發育成生物體。

在又一個方面中，本公開內容提供了一種方法，所述方法包括：(a)提供一種細胞，所述細胞包含整合在所述細胞的基因組基因座內的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列包含與外源性啟動子可操作地連接的外源性GOI，和其中所述基因座包含延伸的無甲基化CpG島；和(b)在能夠使所述外源性GOI表達的條件下培養(a)中的所述細胞。在一個實施方式中，所述外源性GOI編碼目標蛋白(POI)，且所述方法還包括收集所述POI。

附圖說明