[發(fā)明專利]用于單細胞的大量平行組合分析的系統(tǒng)和方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880018231.1
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN110431233B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·S·約翰遜;A·S·阿德勒;M·J·斯平德勒;R·A·米茲拉希
• 申請（專利權(quán)）人: 吉加根公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 陳文平;劉盈盈

本文提供了使得能夠在與其他類型的單細胞孵育的背景下平行評估個體細胞或細胞亞群中的多種功能性核酸的方法。關(guān)鍵的見解是同時測量衍生自至少兩種不同細胞類型的小群體的多核酸，使得一種細胞類型的功能與另一細胞的克隆身份相關(guān)聯(lián)。這些方法同時處理數(shù)千、數(shù)百萬或更多單細胞或小細胞群。所述方法集成了分子、算法和工程方法。本發(fā)明在許多生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛和有用的應(yīng)用，包括免疫學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2017年3月13日提交的美國臨時申請?zhí)?2/470,836的權(quán)益，該臨時申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

序列表

本申請包含已經(jīng)通過EFS-Web提交的序列表，并且其全部內(nèi)容通過引用并入本文。在2018年3月13日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝命名為39523WO_CRF_SequenceListing，大小為35,480字節(jié)。

背景技術(shù)

生物細胞是極其多樣的和產(chǎn)生極其多樣化的生物學(xué)功能。因此，細胞的功能性分析幾乎是任何生物學(xué)實驗的基本要求。因為甚至遺傳上同質(zhì)的單細胞群具有異質(zhì)的生物學(xué)功能，所以生物學(xué)實驗最好在單細胞水平上進行。然而，使用常規(guī)方法難以或不可能進行單細胞功能性分析。

傳統(tǒng)地，在響應(yīng)于暴露于“誘導(dǎo)細胞”，“靶細胞”的功能性分析在組織培養(yǎng)板中進行，例如，6孔或96孔板上。將感興趣的靶細胞與誘導(dǎo)細胞類型一起孵育，然后通過評估蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄物或其他種類的生物標志物來測量靶細胞的應(yīng)答。這樣的方法總是在大量群體上進行，即數(shù)百、數(shù)千或數(shù)百萬個靶細胞與數(shù)百、數(shù)千或數(shù)百萬個誘導(dǎo)細胞一起孵育，以確定靶細胞對誘導(dǎo)細胞的響應(yīng)。然而，靶細胞群和誘導(dǎo)細胞群在遺傳和表型上具有固有的多樣性。即使具有難以區(qū)分的基因組序列的細胞也可能對誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生不同的反應(yīng)，因為表觀遺傳差異、環(huán)境差異或科學(xué)目前未知的原因。

此外，尚未獲得對單個靶細胞或誘導(dǎo)細胞進行功能測定足夠靈敏的方法。通常，誘導(dǎo)細胞和非誘導(dǎo)細胞之間的轉(zhuǎn)錄物計數(shù)的定量差異僅為2倍、5倍或10倍，因此需要高度靈敏的方法。類似地，尚未獲得足夠高通量以平行測定數(shù)百萬個單靶細胞或誘導(dǎo)細胞的方法。另外，功能性分析通常需要同時測量靶細胞和誘導(dǎo)細胞兩者中的轉(zhuǎn)錄物，例如，通過同時測量和測序兩種細胞類型中的轉(zhuǎn)錄物。如果沒有這樣的靈敏、高通量和組合篩選方法，就很難理解暴露于誘導(dǎo)細胞的單個靶細胞的功能響應(yīng)，更不用說平行的數(shù)百萬個單靶細胞或誘導(dǎo)細胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種與用于檢測靶細胞對誘導(dǎo)細胞的響應(yīng)的方法相結(jié)合的可以分離單靶細胞與單誘導(dǎo)細胞或誘導(dǎo)細胞群的高通量技術(shù)(圖1)。在一些實施方式中，靶細胞和誘導(dǎo)細胞另外與“中間”細胞一起孵育，所述“中間”細胞是一種誘導(dǎo)細胞。本發(fā)明提供了一種用于檢測誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)細胞之間僅為2倍、5倍或10倍的轉(zhuǎn)錄物計數(shù)定量差異的高靈敏度的方法。本發(fā)明還能夠進行組合測量，使得可以以數(shù)百萬種可能的成對組合分析不同的靶細胞群和誘導(dǎo)細胞群。本發(fā)明的一些方法涉及通過系鏈(tether)或連接來自一種以上細胞類型的多核酸而產(chǎn)生的多核酸的定量。所述方法提供了在孔板方法中不可能的單細胞功能篩選的新方法。所述方法進一步提供了追蹤功能性讀取結(jié)果至單靶細胞、中間細胞或誘導(dǎo)細胞中的遺傳差異的能力。

本發(fā)明的一個方面涉及一種用于生物細胞的功能性分析的方法，其包括：(1)將來自第一細胞類型的多個靶細胞克隆的單個靶細胞和來自第二細胞類型的多個誘導(dǎo)細胞克隆的一個或多個誘導(dǎo)細胞分離成單分散乳液微滴；(2)在所述單分散乳液微滴中孵育分離細胞，其中所述分離細胞包含所述單個靶細胞和所述一個或多個誘導(dǎo)細胞；(3)將含有裂解試劑的水溶液引入到所述單分散乳液微滴中，從而誘導(dǎo)所述分離細胞的裂解；(4)捕獲從固體表面上的所述分離細胞釋放的RNA；和(5)產(chǎn)生包含來自所述分離細胞的轉(zhuǎn)錄物的雜交多核酸的文庫，其中所述雜交多核酸指示在孵育所述分離細胞的步驟后所述單個靶細胞的轉(zhuǎn)錄變化。