[發(fā)明專利]工程化的異源二聚體蛋白質(zhì)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880014278.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110382529A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R·塞貝;S·伊里加拉;D·斯凱戈羅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 諾華股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K16/28;C07K16/24
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 胡晨曦;黃革生

本發(fā)明提供了異源二聚體抗體及其片段以及它們的制備方法，其中重鏈和輕鏈的配對(duì)得到改善。界面殘基發(fā)生突變，使得當(dāng)兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈在同一細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染并共表達(dá)以組裝為功能性異源二聚體抗體或其片段時(shí)，每條輕鏈強(qiáng)烈偏向于其同源重鏈。

序列表

本申請(qǐng)含有已經(jīng)以ASCII格式電子遞交的序列表，并且將該序列表通過(guò)援引以其整體特此并入。所述ASCII副本創(chuàng)建于2018年2月20日，名稱為PAT057505-WO-PCT_SL.txt并且大小為201,737字節(jié)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含促進(jìn)正確的重鏈和輕鏈配對(duì)的修飾的異源二聚體抗體及其片段，以及它們的制備方法。

背景技術(shù)

異源二聚體抗體(特別是作為人疾病的治療劑的雙特異性抗體)的施用具有巨大的臨床潛力，但異源二聚體抗體的穩(wěn)健生成，尤其是純的且可開(kāi)發(fā)的異源二聚體抗體的產(chǎn)生仍然具有挑戰(zhàn)性。抗體重鏈以混雜方式結(jié)合抗體輕鏈，使得給定的重鏈可以與λ和κ輕鏈類別的許多輕鏈序列配對(duì)(Edwards BM等人,(2003)J.Mol.Biol.[分子生物學(xué)雜志]334:103-18)。先前的工作已經(jīng)表明，重鏈和輕鏈的配對(duì)是隨機(jī)進(jìn)行的(Brezinschek HP等人,(1998)J.Immunol.[免疫學(xué)雜志]160:4762-7)。作為這種結(jié)合的結(jié)果，兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈的伴隨表達(dá)自然導(dǎo)致重鏈-輕鏈配對(duì)的雜混；然而，同質(zhì)配對(duì)是可制造性和生物功效的基本要求。異源二聚體抗體形式如DVD-Ig(Wu C等人,(2007)Nat.Biotech.[自然生物技術(shù)]25(11):1290-7)、CrossMab(Schaefer W等人,(2011)PNAS[美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊]108(27):11187-92)或“二合一”抗體(Bostrom J等人,(2009)Science[科學(xué)]323(5921):1610-4)允許產(chǎn)生雙特異性抗體，但具有不同的缺陷。盡管存在這些近期發(fā)展，但本領(lǐng)域仍然需要具有正確的重鏈和輕鏈配對(duì)的改善的異源二聚體抗體形式，以及用于實(shí)現(xiàn)這種同質(zhì)配對(duì)以避免生成錯(cuò)配污染物的方法。

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明中，為了改善異源二聚體抗體的重鏈和輕鏈的配對(duì)，應(yīng)用靜電轉(zhuǎn)向機(jī)制對(duì)抗體和抗體片段的子集的重鏈和輕鏈進(jìn)行工程化。界面殘基發(fā)生突變，使得當(dāng)兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈在同一細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染并共表達(dá)以組裝為功能性異源二聚體雙特異性抗體時(shí)，每條輕鏈強(qiáng)烈偏向于其同源重鏈。

用于對(duì)重鏈-輕鏈配對(duì)進(jìn)行工程化的設(shè)計(jì)策略包括鑒定代表性Fab。代表性Fab的標(biāo)準(zhǔn)是它是常用的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)亞組的成員，如VH3和Vκ1或Vλ1。對(duì)于電荷工程化，考慮幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。所選氨基酸應(yīng)不與構(gòu)象結(jié)構(gòu)中的可變結(jié)構(gòu)域CDR接觸，因?yàn)榕cCDR的相互作用接觸可最終導(dǎo)致結(jié)合喪失，因此應(yīng)避免。所選位置在大多數(shù)常見(jiàn)抗體家族內(nèi)應(yīng)是高度保守的，以便能夠生成任何給定亞家族的異源二聚體。另外，通過(guò)避免VH與VL，以及重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1(CH1)與輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)的界面中心的位置，并選擇該界面邊緣處的位置，可以通過(guò)在結(jié)構(gòu)域的末端產(chǎn)生鹽橋并從而產(chǎn)生接近正確的重鏈-輕鏈形成的“夾持效應(yīng)(clip-effect)”來(lái)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)烈促進(jìn)異源二聚體形成的效果。這種“夾持效應(yīng)”用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)并減少恒定結(jié)構(gòu)域CH1和CL的界面的不穩(wěn)定。因此，在VH和VL結(jié)構(gòu)域的末端處以及CH1和CL結(jié)構(gòu)域的起點(diǎn)和末端處引入帶電殘基。在CH1和CL結(jié)構(gòu)域的末端處選擇用于電荷工程化的殘基是基于相應(yīng)主鏈之間最多至的觀察距離，這與基于側(cè)鏈相互作用來(lái)選擇用于修飾的殘基截然不同。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種異源二聚體抗體或其片段，所述異源二聚體抗體或其片段包含在某些位置處包含多個(gè)取代的工程化的VH和CH1結(jié)構(gòu)域以及工程化的VL和CL結(jié)構(gòu)域。所有取代位置的編號(hào)均依照EU編號(hào)。