[發(fā)明專利]DNA零件，途徑和基因組的進(jìn)化指導(dǎo)的多重DNA裝配

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880013090.4
• 申請日: 2018-02-20
• 公開（公告）號: CN110366593A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬提亞·克里森;貝亞特·克里森;海因茨·克里森
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 陳燕嫻

本發(fā)明涉及將DNA零件裝配成數(shù)千堿基長的合成DNA構(gòu)建體的方法。該方法平行地產(chǎn)生多個(gè)同義DNA零件，并以組合裝配方式選擇具有最佳合成和裝配可行性的那些序列變體。DNA零件經(jīng)過序列優(yōu)化并分配成同義變體設(shè)計(jì)，所述同義變體設(shè)計(jì)充當(dāng)用于高級DNA裝配的冗余構(gòu)建單元。該方法的主要階段是：DNA設(shè)計(jì)的計(jì)算分配和同義重編碼，序列變體池的DNA合成，連續(xù)PGR以分離DNA零件組和高級裝配。由于高級裝配不再依賴于每個(gè)DNA零件的成功合成，因此可以快速完成大規(guī)模DNA設(shè)計(jì)以允許合成生物設(shè)計(jì)的高性價(jià)比且高度并行化的裝配。

背景技術(shù)

在過去十年中，高通量DNA測序已經(jīng)改變了生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)的每個(gè)方面。今天，我們處在一個(gè)新時(shí)代的開端，生物科學(xué)從一個(gè)以知識為導(dǎo)向的學(xué)科轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜生物系統(tǒng)的應(yīng)用相關(guān)工程，從而使其高度創(chuàng)新的技術(shù)潛力倍增和資本化，以生產(chǎn)出應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、材料科學(xué)和可持續(xù)食物和生物能源生產(chǎn)的多種分子。

低成本從頭DNA合成技術(shù)的最新進(jìn)展現(xiàn)在首次提供了通過編寫長DNA分子來編程生物功能的能力。未來，DNA的從頭合成將對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生比基因組測序革命更大的變革性影響。在這種轉(zhuǎn)變期間，新的使能技術(shù)，如本文提出的進(jìn)化指導(dǎo)的多重基因組裝配過程，將是成本和時(shí)間有效地制造合成DNA設(shè)計(jì)以加速復(fù)雜生物系統(tǒng)的生物工程的關(guān)鍵。

盡管最近技術(shù)在從頭DNA合成能力、染色體裝配和編輯工具方面突破，快節(jié)奏的從頭DNA合成仍然是有效制造具有完全確定的基因組成的平臺生物的合成生物學(xué)的主要限速步驟。

用于從頭DNA合成的基于硅和芯片的方法現(xiàn)在能夠大規(guī)模制造短雙鏈DNA序列(如通過使用Twist公司、Gen9公司、賽默飛世爾公司(Thermo-Fisher)技術(shù)所例證的)。這些方法能夠同時(shí)產(chǎn)生長千上萬個(gè)短寡核苷酸，這些短寡核苷酸裝配成1kb長的雙鏈DNA分子，并且在下一次迭代中隨后連接成更高級的裝配。然而，由于固相化學(xué)的微型化和限制，先進(jìn)的低成本寡核苷酸制造技術(shù)不能保證每個(gè)DNA嵌段都能以流水線方式制造。

目前大規(guī)模DNA制造工藝的基石仍遵循經(jīng)典化學(xué)合成采用的設(shè)計(jì)原則：首先定義所希望的DNA分子的序列，并且然后在一系列連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)后構(gòu)建精確的拷貝。在從頭DNA合成期間，DNA分子(設(shè)計(jì))的結(jié)構(gòu)(堿基對序列)保持恒定。在隨后的分離和測序過程期間丟棄與初始序列設(shè)計(jì)(或其部分)不同一的副產(chǎn)物或中間體。寡核酸合成和聚合酶鏈裝配(PGA)反應(yīng)期間的合成錯(cuò)誤需要重復(fù)、優(yōu)化和改進(jìn)反應(yīng)條件，直到達(dá)到足夠的產(chǎn)率以進(jìn)行隨后的高級DNA裝配步驟。由于內(nèi)在的分層性質(zhì)，該過程嚴(yán)格依賴于從前面的裝配水平成功制造每個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)單元。因此，合成途徑、基因簇和由成百上千個(gè)DNA嵌段組成的整個(gè)基因組的工程化很快成為不可克服的問題，因?yàn)榧词挂粋€(gè)單一的缺失的DNA嵌段也阻礙了分層裝配，并且因此阻止了DNA設(shè)計(jì)的完成。因此，當(dāng)前的基因組制造被推遲，直到在從頭DNA合成嘗試的迭代循環(huán)期間已經(jīng)獲得了每個(gè)難以合成的DNA嵌段。

發(fā)明內(nèi)容

基于上述背景，本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生可包含完整途徑、基因簇或整個(gè)基因組的大DNA構(gòu)建體的方法。

該目的通過具有根據(jù)權(quán)利要求1所述的特征的方法實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的實(shí)施例陳述于從屬權(quán)利要求和以下說明中。

據(jù)此，本發(fā)明的第一方面涉及用于制造目的大DNA構(gòu)建體的方法。該方法包括以下步驟：

-提供包含多個(gè)遺傳元件的計(jì)算機(jī)模擬模板DNA構(gòu)建體；

-使計(jì)算機(jī)模擬模板DNA構(gòu)建體經(jīng)歷計(jì)算優(yōu)化步驟，其中通過中性序列改變，特別是通過在包含在一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列內(nèi)的情況下中性密碼子替換或通過包含在一個(gè)或多個(gè)基因間序列內(nèi)的情況下中性堿基取代插入、缺失或同義序列替換，從計(jì)算機(jī)模擬DNA構(gòu)建體模板中去除抑制從頭DNA合成的一個(gè)或多個(gè)序列，產(chǎn)生優(yōu)化的計(jì)算機(jī)模擬DNA構(gòu)建體，并且起始密碼子不被去除或替換；