[發明專利]DNA零件，途徑和基因組的進化指導的多重DNA裝配

在審

• 申請號: 201880013090.4
• 申請日: 2018-02-20
• 公開（公告）號: CN110366593A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 馬提亞·克里森;貝亞特·克里森;海因茨·克里森
• 申請（專利權）人: 蘇黎世聯邦理工學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 陳燕嫻

1.一種用于制造目的DNA構建體的方法，該方法包括以下步驟

-提供包含多個遺傳元件的計算機模擬DNA構建體模板；

-使所述計算機模擬DNA構建體模板經歷計算優化步驟，其中通過中性序列改變從所述計算機模擬DNA構建體模板中去除抑制從頭DNA合成的一個或多個序列，產生優化的計算機模擬DNA構建體，并且起始密碼子未被去除或替換；

-在分配步驟中將所述優化的計算機模擬DNA構建體分配成多個原始計算機模擬裝配單元，其中所述優化的計算機模擬DNA構建體的分配使得所述多個原始計算機模擬裝配單元中的每兩個相鄰單元共享末端同源區，其中每個末端同源區不同于任何其他末端同源區；

-使所述多個原始計算機模擬裝配單元中的每個單元經歷計算同義序列重編碼步驟，其中

·通過中性序列改變為所述多個原始計算機模擬裝配單元中的每個單元產生一個或多個同義計算機模擬裝配單元，并且不改變末端同源區或起始密碼子，和

·產生包含所述多個原始計算機模擬裝配單元中的所述單元以及所述一個或多個同義計算機模擬裝配單元的計算機模擬裝配變體池，從而產生計算機模擬變體池文庫；

-從頭合成所述計算機模擬變體池文庫的每個計算機模擬裝配變體池中的一個或多個單元，從而產生核酸裝配單元文庫；

-在擴增步驟中擴增所述核酸裝配單元文庫，產生擴增的核酸裝配單元文庫；以及

-在裝配步驟中將所述擴增的核酸裝配單元文庫在體外或體內裝配成所述目的DNA構建體。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述中性序列改變包括

-蛋白質編碼序列中的中性密碼子替換，和/或

-基因間序列中的中性堿基取代、插入或缺失或同義序列替換。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中將第一可分離的適配子序列添加到每個計算機模擬裝配變體池的每個單元的一個末端，并且將第二可分離的適配子序列添加到每個計算機模擬裝配變體池的每個單元的另一個末端，其中

-所述第一可分離的適配子序列和所述第二可分離的適配子序列具有不同的序列，并且其中任選地，在擴增步驟中使用能夠退火至所述第一可分離的適配子序列的第一引物和能夠退火至所述第二可分離的適配子序列的第二引物；以及

-在所述裝配步驟之前，從所述擴增的核酸裝配單元文庫的每個單元去除所述第一可分離的適配子序列和所述第二可分離的適配子序列。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述第一可分離的適配子序列包含第一引物結合區和第一切割位點，并且所述第二可分離的適配子序列包含第二引物結合區和第二切割位點，其中所述第一切割位點和所述第二切割位點可被不同的內切核酸酶特異性識別。

5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的DNA構建體是線性核酸分子、諸如質粒的環狀核酸分子或人工染色體。

6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，所述目的DNA構建體具有至少10,000個堿基對的長度，特別地是至少1000,000個堿基對的長度。

7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多個原始計算機模擬裝配單元中的每個單元彼此獨立地具有500個堿基對至3,000個堿基對范圍內的長度。

8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述彼此獨立的末端同源區各自具有15個堿基對至35個堿基對或更長的長度。

9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述遺傳元件選自操縱子、啟動子、開放閱讀框、增強子、沉默子、外顯子、內含子或基因。

10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述末端同源區包含在蛋白質編碼序列或基因間序列內。